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PNB Designer:用于设计Prime和Base Editor指南RNA用于动物和植物的Web应用程序

抽象的

背景

通过将效应域标记为酶活性CAS9(DCAS9)或CAS9酸碱酶(NCAS9)的快速扩展通过标记为酶促的CAS9(DCAS9)导致了几种有前途的新基因编辑策略。最近的添加包括CRISPR胞嘧啶或腺嘌呤基础编辑器(CBES和APE)和CRISPR PRIME编辑器(PE),其中脱氨酶或逆转录酶分别融合到NCAS9。这些工具对模型和造成动物和植物模型中的疾病突变具有巨大的希望。但到目前为止,不存在可自动化的可用工具,以自动化BE和PE试剂的设计。

结果

我们开发了PnB Designer,一个基于web的应用程序,用于设计用于PEs的pegRNAs和指导用于BEs的rna。PnB设计器使得设计针对单个或多个目标的靶标引导rna从生物体跨多个王国的变异或参考基因组上。在PnB Designer的帮助下,我们设计了pegRNAs来模拟所有已知的导致ClinVar突变的疾病。此外,PnB Designer可用于设计引导rna安装或还原SNV,用一个CBE和七个不同的ABE PAM变体扫描基因组,并返回最佳的be使用。PnB设计师是公开访问在http://fgcz-shiny.uzh.ch/pnbdesigner//

结论

使用PNB设计人员,我们为CRISPR PE创建了一个用户友好的设计工具,并且是可试剂,这应该简化选择编辑策略并避免设计并发症。

背景

由于发现CRISPR(群集定期间隙的短语重复)基因座和相关的CAS9蛋白,因此基因组工程的景观大大变化了1]。在人类细胞中成功应用基因编辑后,CRISPR-CAS9研究创造了一个完全新的和快速移动的场,具有爆炸的出版物数量[12]。由引导RNA(GRNA)指导,CAS9蛋白的内切核酸酶活性引入目标基因座的双链断裂(DSB)[1]。每个Cas9诱导的DSB可以被解析为错误的插入或删除(Indel)或精确,模板的同源定向修复(HDR)事件[3.]。融合各种效应域以催化受损的CAS蛋白质的型号导致了一种突出的工具,其外的indels和hdr [2]。

CRISPR基础编辑器(BES)使用胞嘧啶或腺嘌呤 - 脱氨酶蛋白,以分别从C→T或→G的DNA碱基转变产生[4.5.]。虽然与CAS酶结合的GRNA引导到基因组轨迹,但脱氨酶可以在某个窗口内编辑其目标基础[4.5.]。基础编辑器已在许多动物和工厂模型中使用,并对疾病导致的单一核苷酸变异(SNV)进行广泛的疾病来保持巨大的希望[6.7.8.9.1011]。腺嘌呤 - 脱胺酶基础编辑器(eBES)特别表现出高效率的高效率与低靶DNA和RNA编辑的高效组合[1213]。相比之下,一些早期CBES版本遭受偏离目标活动[12]但只有这些CBE或靶辅助型CBE的新工程版本表现出足够的特异性来考虑治疗应用[131415]。

即使是最近,PRIME编辑器(PES)介绍了没有HDR的小可编程基因组变化的可能性。PE2由与工程逆转录酶融合的Cas9酸氨酸酶组成[16]。为了在基因组中引入修饰,PE使用由20nt引导序列,引物结合位点(PBS)和逆转录酶模板(RTT)组成的初始编辑延伸导向RNA(PEGRNA)。16]。该引导将CAS酶引导至靶位点,PBS与相反的链杂交以使逆转录酶掺入,并且RTT整合所需的基因组改变。为了进一步优化PE2,PE3系统使用另一个指南,将缺口引导到未编辑的互补链,移位DNA修复的平衡以支持编辑的链[16]。如果编辑后的链在RTT序列合并之前被切割,这种二次切割可能会导致indels,这是最近发现的情况[17]。然而,PE3B系统通过使用与预期的编辑的第二指南来解决这个问题,使得野生型链上的缺口仅发生在成功的序列结合在编辑的链中[16]。因此,对于想要避免潜在脱靶的用户,我们建议使用PE2或PE3b系统。

手工设计一个复杂的pegRNA和多个切割位点可能是费力的、具有挑战性的和容易出错的,特别是在初级编辑的早期,优化可能需要设计和测试多个pegRNA。轻松设计pegRNAs的软件将使这一激动人心的新技术更容易为广大用户所接受。有几种基于web的BEs设计工具[181920.]。但是,据我们所知,没有公开可用的软件,可以设计基本编辑和素质编辑GRNA。

在这里,我们介绍了PNB Designer工具,是PE,CBE和最近eBES的GRNA设计的基于Web的应用程序应用程序,如abemax和abe8e [2122]。PNB Designer为用户提供直观的界面,使编辑策略和目标站点选择直接。它生成有用的输出命令,以通过设计问题引导用户,并以简单易懂的方式展示所产生的指南。我们还使用PNB设计师来设计候选人的PEGRNA来模拟Clinvar中的所有人类突变。包括多种类型的Clinvar靶向人的PEGRNA设计,以帮助使用PES设计实验。PNB Designer对其他BE设计WebServers比较,是我们所知的第一个和PE设计WebServer(表1)。

表1 PNB设计器与其他指南RNA设计应用之间的比较表

执行

PNB Designer是一个用于设计CRISPR PRIME和基础编辑器的GRNA的Web应用程序。写在R,PNB设计师建造有闪亮的包[23]和生物导体[24.25.]。该应用程序包括每个输入后的反馈,以帮助用户避免在基础和Prime编辑GRNA的复杂设计中避免缺陷。用户友好的界面与结果可视化中的说明和解释性弹出窗口组合,使用户可以访问所有级别的用户。

在每次gRNA设计运行中,用户可以选择编辑策略和目标基因组(图。1一种)。在“基因组面板”中,用户可以选择常用生物的基因组,例如智人,肌肉小家鼠Danio Rerio.。此外,由于基因组操作应用,如' '和碱基编辑已成功部署在植物[9.26.27.],奥雅萨苜蓿(亚洲大米),拟南芥(Thale Cress)和vitis Vinifera(普通葡萄)也包括在“基因组面板”。用户也可以在“基因组面板”中选择“以上皆非”,并在后面的面板中选择“序列输入”,输入自己的目标序列,使非模式生物或合成结构的gRNAs设计成为可能。

图。1
图1

PnB设计器的用户界面概述。一种PNB设计器应用程序在“多样化运行”模式下的用户界面的图形布局。在第一个输入字段中,用户可以选择编辑策略,基本或PRIME编辑和运行模式。选择“多样本运行”模式时,可以将具有用户指定样本的CSV文件加载到批量分析的应用中。B.模板CSV文件可在“主要编辑模板文件”链接下下载,其格式如面板b所示。C“Single Sample Run”模式下的用户界面。编辑位置可以使用基因组坐标或作为原始文本序列来定义

最后,用户可以决定为一次编辑设计BE或PE gRNAs,或者使用逗号分隔值(CSV)格式文件作为输入自动设计多个gRNAs(图。1b)。在处理用户的查询后,PNB Designer允许用户通过单击输出表下方的下载按钮之一来保存GRNA搜索的结果。

结果

使用PNB设计器用户界面进行PRIME编辑

选择“Prime编辑”选项,用户可以通过将交换机按钮设置到左或右位置来安装所需的编辑或校正任何类型(替换,插入,删除)的某个突变(图。1C)。用户可以使用基因组坐标或以文本格式输入目标序列(图。1c). PBS和RTT长度是pegRNA设计成功的重要参数。虽然建议PBS长度为~ 13 nt, RTT长度为10-16 nt,但尚未确定它们值的精确规则,可以通过改变RTT长度来优化pegRNA效率[16]。因此,在PNB设计器中,PBS和RTT长度默认设置在13 NT的建议值下设置,但可以由用户容易地修改。

PEGRNA的设计策略

PNB Designer扫描了感觉和反义股线,以查找编辑位置周围的所有可能的5'-ngg-3'原始主题(PAM)站点,开始+ 6 nt到所需编辑的3'末端,然后扫描100nt5'方向,让用户选择一个非常遥远的PAM选项。由于缺乏使用PE的实验验证,目前尚未探索非NGG PAM,但预计将扩展到其他PAM并因此将增加其支持,以将来的PNB设计师版本添加到未来版本中。就距编辑位置和输入RTT长度的距离而存储和评估所有可能的NGG PAM。如果RTT完全覆盖,则PEGRNA被视为可能的候选者。然后,PNB设计器将原子晶仪,PBS和RTT序列存储。编码股上的预期编辑也被突出显示确认。根据Liu Lab的建议,设计并过滤了PE3和PE3B系统的切口指南,以提供合适的GRNA选择[16]。对于PE3,仅考虑仅初始缺口的40-100NT 40-100 NT的切口引导件。对于PE3B,仅显示与PE2 PAM或PROPACAL序列部分重叠的互补链上的PAM序列,如LIU实验室所示的PE3B手动设计方案所示。

使用PNB设计器进行素质编辑:结果可视化

在成功运行之后,所得到的序列被示出在输出表中(图。2a,b)具有以下参数:变体名称,'pegrna得分',prodospacer序列,相对于pam,pam序列,pam股线和编码链3'延伸的编辑位置,具有实施的编辑。作为每个Pegrna的质量的指标,我们基于刘实验室的建议实施了“Pegrna评分”方程[16]。我们的目的是自动化几个启发式约束,否则需要手动评估每个pegRNA,允许用户对极不可能工作的pegRNA进行分类。因此,“pegRNA评分”类似于对正常grna的早期评分系统。与形成dsb的Cas9编辑一样,大量关于使用许多不同的pegRNAs进行初级编辑的效率的数据可能在未来使机器学习等方法能够预测pegRNA效率。

图2
图2.

在' Single Sample Run '和' Multi Sample Run '中pegRNA输出表的概述。一种“单个示例运行”输出表与所选变体的所有可能的PEGRNA。编辑以红色粗体文本可视化。可以通过单击每列来获得有关编辑位置以及“Pegrna-score”的计算的更多信息。B.“多示例运行”输出,概述变体和输出表。标题显示有多少变种可以针对可能的人的pegrna。默认情况下,显示每个变体的“Pegrna-score”最高的pegrna。显示一个下载按钮,您可以通过克隆网站直接下载Pegrna Oligos以进行后续订购

实施简单的“Pegrna评分”是为了使用户了解其PeGRNA的任何设计特征,这可能在anzalone等人所述的条件下使用时妨碍PEGRNA的功能。[16]。PEGRNA评分遵循刘实验室所建议的相同的惩罚系统,较大的负数表明PEGRNA设计更糟糕。在3'延伸编辑中的第一碱基的情况下,通过与Cas9的G81配对,由于GRNA结构的破坏,可能导致较低的效率[16在这种情况下,建议增加RTT长度。在pegRNA的3 '延伸部分的多个胸腺嘧啶(T)核苷酸(超过4个)被严重惩罚(得分−50),因为当前的pegRNA质粒利用了RNA聚合酶III启动子,胸腺嘧啶延伸被识别为转录终止信号[28.]。在PEGRNA中的影响也被发现是最重要的特征之一,预测了第一题中的一个中的PE2效率的降低[29.]。另一个需要考虑的重要问题是预期编辑后同源碱基的数量。这应该大于5nt,如果可能的话,甚至大于10nt,以增加这一端的退火。因此,如果同源核苷酸的数目少于5个,则判为−6。最后,如果编辑距离最初的缺口位置很近,PE是最有效的。因此,在原间隔子或PAM中放置编辑位置的pegRNAs是更可取的(编辑位置1-6)[16[每增加编辑位置的惩罚 - 1对PEGRNA给出了与这种最佳设计的偏差。所有惩罚的总和定义了“PEGRNA分数”。pegrna设计的实例(附加文件)1:图1a,第一行)和较差的分数(附加文件1:图1A,最后两排)可以在补充信息中看到。接收多个惩罚的PEGRNA非常不可能处于活动状态,因此可以从测试中省略。然而,在这个初期编辑的早期阶段,我们不建议使用PEGRNA评分作为类似得分的PEGRNA之间的鉴别器。它是建议用户采用宽松的阈值并通过实验测试多个PEGRNA,跨越广泛的良好分数。例如,来自anzalone等人的所有pegrnas。数字4.A在-14和-1之间具有良好的人权评分,但这些合理评分的PEGRNA之间只有轻微相关性及其效率。anzalone等人报告了具有良好编辑效率的PEGRNA。有一个高的人们惩罚,支持Pegrnas的分数,得分差(附加文件2:图2)。

从输出表中,用户可以选择所需的PEGRNA,并且如果希望,则可以实现PE3或PE3B系统。如果是,他们将根据上述设计建议提供潜在的切口指南。在PEGRNA和任选的切口指南选择后,可以直接下载它们的序列,包括用于克隆到来自anzalone等人的BSMBI消化的受体载体的适配器。和刘实验室涂在addgene [#132777]上沉积的Pegrna受体矢量。

在多样本模式的输出表中,只显示了一个变体中得分最高的pegRNA。用户也可以通过选择“显示所有可能的pegRNAs”框来访问所有的pegRNAs。1一种)。对于具有特定输入条件的不可定位变体,显示具有不成功搜索可能原因的行。此外,用户还可以下载所有PEGRNA的寡核苷酸,并用克隆延伸部门用于直接金门组件进入PU6-PEGRNA-GG-受体质粒[16]。

使用Prime编辑重建PEGRNA的自动化设计,重建Clinvar基因型

我们使用PnB Designer设计候选pegRNAs模型所有已知的人类致病性或可能的致病性核编码变体在ClinVar [30.](https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/clinvar/tab_delimited/variant_summary.txt.gz.),过滤到PE的目标删除,重复,插入和SNV [16]。我们开始使用包含71,006个SNV,24,373删除,10,199个重复和1677个插入的输入Clinvar数据集。我们发现,通过PBS和RTT长度为13 NT,我们可以靶向71,006个SNV(81%),17,471名,24,373(72%)缺失的57,537,其中7040分,其中10,199(69%)重复,1077分,满分1677(64%)插入(图。3.a,b)。总的来说,我们检索合适的PEGRNA设计78%的分析变体。由于RTT长度的约束没有实验良好定义,因此我们使用从10到20nt的RTT长度重复该分析。正如预期的那样,更少的变体具有较短的RT模板,并且在20NT的最长长度的RTT长度上,我们能够设计PEGRNA以获得所有Clinvar输入变体的87%(图。3.C)。With a RTT length of 13 nt the ‘pegRNA Score’ distribution shows that the majority of pegRNAs have a score of − 20 and higher, which shows that only some pegRNAs suffer from additional penalties (3′ C or multiple thymine in the extension) (Fig.3.d)。可定位变体的频率尚不高原具有20nt的高原,但越来越多的RTT可能会在已经长的Pegrna中引入问题。总之,我们能够使用PNB设计者成功地设计用于人类变体的大型数据集的PRNA。可以访问所有RTT长度的所有Clinvar定位Pegrnas(附加文件)。

图3.
图3.

pegRNA设计建模所有致病性和潜在致病性snv,插入,复制和缺失在ClinVar。一种在设计109,565变体的数据集中设计Pegrnas后的输出表。使用具有13 NT RTT的素数来定位83,125变体。B.定量数据集中不同类型的变体和可占用蓝色突出显示的每种类型的PE的变体的比例,分别以红色占有。条中的黑色数字代表变体数(RTT长度:13 nt)。C使用不同长度的RT模板(10-20 nt)可靶向致病性和可能致病性变异的比例。D.每个变体的最高分数' pegRNA-Score '的分布(RTT长度:13 nt)。大多数pegRNAs的得分都大于- 20,这表明这些可能是没有重大设计缺陷的功能性pegRNAs。使用包ggplot2生成的数字[37.]与r(版本3.6.3)

使用PNB设计器进行基础编辑:用户界面

选择“基本编辑”选项时,用户可以以文本格式输入目标序列,或者选择基因组坐标,目标区域的方向和它们想要恢复到参考野外序列序列的SNV(图。4.一种)。PNB设计人员支持eBES和CBE的GRNA设计。由于早期CBE的已知脱靶施力,已经实施了偏离目标下降的工程化版本:BE3(R33A),BE3(R33A / K34A),BE3-HA3A(R128A)和靶标识,所有识别5'-ngg-3'pams [131415]。而PnB Designer可以基于SpCas9 (酿脓链球菌)和Saca9(链球菌金黄色葡萄球菌, 5 ' -NGG-3 ' (SpCas9), 5 ' - ngga -3 ' (SpCas9- vrqr), 5 ' -NGCG-3 ' (SpCas9- ng), 5 ' -NNGRRT-3 ' (SaCas9), 5 ' -NNNRRT-3 ' (SaCas9- kkh)和新的通过结构引导工程创建的版本SpG 5 ' -NGN-3 '和SpRY 5 ' -NRN-3 ',以及较小程度上的5 ' -NYN-3 ' [5.31.32.33.34.35.]。

图4.
图4.

基础编辑输入和输出概述。一种段特定用户界面。可以由用户提供文本格式的目标序列来安装编辑。为了校正特定的SNV,必须由使用者提供基因组坐标和基因的取向。C→T或G→可以选择SNV以进行校正。B.示例“单个示例运行”用于随机Clinvar变体。目标腺嘌呤以红色突出显示。可以修改的编辑窗口中的其他adenines以蓝色为蓝色。示出了相对于PAM,PAM序列和相应的ABE的编辑位置。C示例“多示例运行”的基本编辑模板

GE GRNA的设计策略

用户可以输入序列或基因组坐标。在手动序列输入期间,用户可以选择所需的单个键对变化(例如A> G以将该位置的腺嘌呤转换为鸟嘌呤)。随着基因组坐标的输入,PNB设计者从所选参考基因组检索基因组序列,并将特定变体序列转换为包括SNV。给出所得序列在给定Cas9-abe和-cbe变体的编辑窗口的正确距离的正确距离中的PAM站点[5.13141531.32.33.34.35.]。通过ABES,C→T基因组变体可以通过在反义链上的→G转换来恢复,以在感测股线上实现预期的编辑。类似地,使用CBES,C→T和G→转换是可能的。所有以前描述的具有各自编辑窗口的PAM变体都会针对编辑测试,允许用户选择所需结果的最佳工具。编辑窗口是基于实验数据定义的。例如,通过来自Base 5-7的编辑窗口实现ABEMAX,基础1是PAM站点中最远端的[22]。另外,对于BE3(R33A / K34a),还包括编辑旁边的5'T的强序列偏好[13]。

使用PnB设计器进行基础编辑:结果可视化

结果GRNA显示在输出表中,目标基数以红色突出显示。在可以改性的给定编辑窗口中的旁观者腺嘌呤或细胞苷以蓝色突出显示,呈现在目标位点上的脱氨酶的潜在偏离靶标。使用此信息,用户可以轻松地选择“清除”GRNA(图。4.b)。输出表由20 nt protospacer序列(针对变体序列),编辑位置,Pam站点和建议的基本编辑器组成,可以针对此变体。单击相应列可以找到有关编辑位置的其他信息。与其他实施的基础编辑器相比,新开发的近乎Pamless SPCAS9变体SPRY底座编辑器具有较低的整体效率[31.]。我们将此信息包含在输出表中,以指导用户在多个abe能够针对一个站点时使用最有效的编辑策略。一个好的基础编辑指南的例子,没有旁观者基础可以在补充信息(附加文件1:图1b,第三行)。

结论

总之,PNB Designer是一种灵活和用户友好的Web应用程序,用于单个和批量设计(图。1B,4.c)PE PEGRNA和GRNA。PNB Designer允许用户轻松设计PEGRNA,降低对PE应用程序的屏障。此外,我们还实现了具有各种PAM变体的最新CBE和APE,尚未在其他基本编辑设计WebServers中使用(表1)。虽然其他设计工具提供自定义基本编辑器选项以选择新的PAM和编辑窗口,我们认为使用实验建立的编辑窗口实现最新的基本编辑器使其更加用户友好。由于基本编辑器字段快速前进,因此将在开发时添加对新基础编辑器的支持。为了评估由SGRNA的不匹配容差产生的偏离目标,我们建议使用CAS-IFFINER(http://www.rgenome.net/cas-offinder/) [36.]。来自输出表的导向序列可以很容易地传输和验证,这对于在偏移静止敏感应用程序上工作的用户尤为重要。

由于'PEGRNA评分'代表第一次尝试排名PEGRNA活动并基于早期的PE应用[16,它只能作为一个指标使用。随着对高效pegRNA设计的依赖出现,这个分数将被细化。此外,建议用户在自己的实验模型中测试多个pegRNAs的效率。这是由PnB设计师简单。我们的数据集预先设计的PE指南的大多数ClinVar变体使用各种各样的RTT长度(附加文件),提供了一个容易的参考,实验人员寻求建模一个潜在的致病的人类突变。进一步增加RTT长度可能会增加可靶向变体的数量,但这导致了极长pegrna的折衷。最后,我们可以说PnB Designer是一个创新的基因编辑研究的web应用程序,可以支持快速发展的基因编辑策略的翻译研究。

可用性和要求

可用性数据和材料

文章(及其附加文件)中包含了支持本文结论的数据集。

缩写

eBES:

CRISPR腺嘌呤基础编辑

贝斯:

CRISPR基本编辑

Cas9:

CRISPR相关9.

CBES:

胞苷脱氨酶基础编辑器

CRISPR:

集群定期间隔的短文重复

DCAS9:

惰性酶Cas9

DSB:

DNA双链断裂

gRNA:

指导RNA

HDR:

同源性定向修复

indel:

插入或删除

NCAS9:

Cas9 nickase

帕姆:

Protospacer相邻的主题

PBS:

底漆结合位点

pegRNA:

Prime编辑扩展指南RNA

PES:

CRISPR '编辑

RTT:

逆转录酶模板

SNV:

单核苷酸变异

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下载参考

致谢

我们感谢苏黎世功能基因组学中心(FGCZ),特别是Hubert Rehrauer博士和Ge Tan博士主持这个网络应用程序。我们感谢玉米实验室成员的有益讨论。我们感谢所有的ClinVar提交者分享他们的数据。

资金

J.E.C.被纳米斯基金会和乐天和阿富夫热泉·斯普朗斯特恒腾(E.)支持。受到贫血研究基金会的支持。开放机票的资金:Nomis Foundation和Lotte和Adolf Hotz-Sprenger Stiftung。资助者在研究设计,数据收集和分析中没有作用,决定发布或准备稿件。

作者信息

从属关系

作者

贡献

SMS,EK,ZK,JEC构思了这个项目。SMS构建了本研究报告的PNB设计师。SMS,EK,JEC写了稿件。ZK,MSS给了他们的专业知识来改善手稿。所有作者阅读并认可的终稿。

相应的作者

对应于雅各E.玉米

伦理宣言

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

利益争夺

提交人声明他们没有竞争利益。

附加信息

出版商的注意事项

欧宝体育黑玩家Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。

补充信息

额外的文件1。

图。1。PE和BE的良好和次优指南设计的示例输出表。一种初级编辑的示例输出表,显示pegRNA设计具有高的“pegRNA评分”,没有额外的惩罚(第1行),以及pegRNA遭受设计缺陷,因此分配了低的“pegRNA评分”(第5和6行)。B.基本编辑的示例输出表。三种不同的CBE可以瞄准这种SNV。然而,其中两种在编辑窗口中的旁观者底座(以蓝色标记为蓝色),这也可以编辑(第1行和第2行)。因此,使用目标辅助装置(第3行)的使用应优先考虑在该基因座上的“清洁”编辑。

额外的文件2。

图2。散点图,显示了“Pegrna评分”与报告的PEGRNA的编辑效率。anzalone等人报告的pegrnas。如图。4.A与PNB设计者计算的PEGRNA评分绘制了它们各自的平均编辑效率。拟合线性回归来研究这两个变量与A之间的关系2得到值为0.297。图采用MS Excel(2016)制作。

权利和权限

开放获取本文根据创意公约归因于4.0国际许可证,这允许在任何中或格式中使用,共享,适应,分发和复制,只要您向原始作者和来源提供适当的信贷,提供了一个链接到Creative Commons许可证,并指出是否进行了更改。除非信用额度另有说明,否则本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创造性公共许可证中,除非信用额度另有说明。如果物品不包含在物品的创造性的公共许可证中,法定规定不允许您的预期用途或超过允许使用,您需要直接从版权所有者获得许可。要查看本许可证的副本,请访问http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。“创作共用公共领域”豁免书(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)适用于本文提供的数据,除非在数据的信用额度中另有说明。

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Siegner,S.M.,Karasu,M.E.,Schröder,M.S.等等。PnB Designer:一个web应用程序,设计动物和植物的基本和碱基编辑指导rna。欧宝娱乐合法吗22日,101(2021)。https://doi.org/10.1186/s12859-021-04034-6

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