跳过主要内容

基于Web的LINREGPCR:用于可视化和分析(RT)-QPCR扩增和熔化数据的应用

摘要

背景

已经显示出扩增和熔化曲线的分析,以提供有关定量PCR(QPCR)实验中各种反应的质量的有价值的信息,并导致更可靠和可重复的定量结果。

实现

扩增曲线分析的主要步骤是:(1)独特的基线减法,不使用基相循环,(2)从单个反应的指数阶段确定PCR效率,(3)设定常用的定量阈值问:每次反应。熔化曲线分析包括观察到的荧光数据的平滑,归一化以通过将其熔化温度与预期扩增产物的已知熔化温度进行比较,去除术语无关的荧光损失,峰值呼叫和对正确峰的评估。

结果

LINREGPCR Web应用程序提供单个QPCR运行的可视化和分析。用户界面显示分析结果对突出显示的表格和图表中的放大曲线分析和熔化曲线分析。表格中的注释结果可以导出用于计算基因表达比率,实验条件与进一步统计分析之间的折叠变化。基于Web的LINREGPCR地址两种类型的用户,湿式实验室科学家分析了自己的QPCR实验和生物信息管理员的放大和融化曲线,通过将其功能分解为独立的后端RDML来分析一系列QPCR实验(实时PCR数据标记语言)Python库和多个伴随数据可视化,分析和交互式访问的应用程序。使用RDML数据标准使得机器独立存储和QPCR数据交换和RDML-Tools从QPCR仪器导出的文件中导入QPCR数据。

结论

这些分析在新开发的基于Web的LINREGPCR中的组合实施(https://www.gear-genomics.com/rdml-tools/)是独立于平台的,比基于windows的LinRegPCR程序的原始版本快得多。此外,基于网络的LinRegPCR包括一种新的统计离群值检测,以及扩增和熔化曲线分析的结合,允许直接验证扩增产物和报告放大人工制品的反应。

背景

PCR反应实时监测产生的荧光数据的分析[1]通常是用qPCR机可用的软件来完成的。一般情况下,qPCR机减去一个基线荧光,设置一个定量阈值,并报告C问:值,即达到该阈值所需的循环次数[2].许多用户只报告这个c问:作为qPCR研究的结果[3.].更高级的用户从标准曲线得出聚合酶链反应效率[4.]并计算QPCR实验的效率矫正结果[5.].已经在这个千年开始,发现了从标准曲线的PCR效率值在机器之间存在不同,并且最令人不安,难以在PCR运行之间繁殖。因此,提出了几种分析扩增曲线的方法[6.7.8.9.10.11.12.13.].这些方法不仅报告C问:从每个放大反应中得到一个效率值和一些质量指标。比较这些方法,LinRegPCR扩增曲线分析得到的qPCR结果变异最低,重现性最高[14.].

监测与dna结合的荧光色素的PCR反应通常用于实验生物学应用,在这些应用中测量许多经常变化的靶标。然而,使用这些染料,人工制品的放大导致放大曲线与正确目标的放大曲线难以区分[15.].熔化曲线分析可以用来检查是否只有正确的产品或更多的产品被放大[16.].此外,表明熔融曲线分析可用于确定不同产品对扩增曲线的贡献,从而纠正报道的QPCR在放大时的结果[17.].

放大曲线分析

扩增曲线包括四个不同的阶段;1)将扩增依赖性荧光低于测量噪声的地相,2)指数阶段具有单调增加荧光值和恒定PCR效率,3)转变阶段,其中PCR效率因限制反应组分而降低,其中PCR效率降低4)扩增停止和荧光的平台阶段保持不变[18.19.].在扩增曲线的对数图中,反应的指数阶段是一条直线,其斜率由PCR效率决定(图2)。1一个黑线)。个体扩增曲线的分析需要以下步骤:(1)基线减法,(2)识别指数阶段,(3)确定PCR效率,(4)呼叫C问:值,和(5)计算目标数量。

图1
图1

基于Web的LINREGPCR的输出摘要。一种具有样品A75_CRE25的井D8的扩增数据。灰色曲线显示了原始数据,棕色曲线基线校正的数据。W-O-L由蓝线限制,并用于选择确定反应的PCR效率的数据点。量化阈值和被称为C.问:用绿色表示。黑线是基于平均PCR效率的相关理想化曲线。B.用样品A75_CRE25熔化井D8的熔化数据。灰色曲线显示了归一化的熔化数据。棕色曲线是负第一衍生数据,并显示熔化峰。灰色区域突出显示预期温度范围,用户提供的预期温度(Tm)作为黑线。扩增产物的峰值(观察到m)在该反应中落入灰度范围内,表明扩增的产品代表预期产品。C适用于出版的扩增曲线分析结果表。D.熔化曲线分析结果表。与Web版本相比,删除了显示预期目标的峰值的第一列,并且灰色背景突出显示相同的列。E.计算修正的N0.和C.问:使用n的值0.和C.问:通过对熔化曲线的放大曲线分析和修正系数的分析,得出了上述结论

基线荧光被定义为观察到的与扩增无关的荧光。这种基线荧光主要是水解探针测定中荧光团不完全猝灭和dna结合染料测定中未结合染料的结果。非特异性引物退火和探针或荧光色素与基因组DNA污染的结合也可导致可测量的基线荧光。在优化的DNA染色法中,在PCR运行结束时,基线荧光低于荧光的1%;在基于探针的检测中,基线仍可能高达观察到的荧光的10%。几乎所有的qPCR机器都通过所谓的地面相周期的荧光值计算趋势线,并将这个基线趋势外推到最后一个周期。因此,这个系统基线是基于最低的、最嘈杂的荧光值。此外,手动设置或更改地面相位的选项为用户偏见打开了大门[20.].基线荧光值的过高或过低会严重影响基线校正扩增曲线指数阶段的斜率,从而决定从这个斜率确定的PCR效率(见下文)。在窗口和基于web的LinRegPCR中都实现了自动基线估计,它是独立于用户的,不使用地面相位测量。该基线确定使用迭代方法确定基线值,该基线值在对数(荧光)与周期数图的一条直线上留下最多的数据点[13.].原始荧光数据的比较(图。1灰色曲线)具有相同反应的基线校正数据(图。1A,棕色曲线)显示了直指数阶段的重建。附加文件说明了在线性和对数荧光尺度上的观察到的和基线校正的荧光数据[查看附加文件1].

为了确定基线校正放大曲线中的指数阶段,必须确定显示荧光值持续增加的循环子集。这个指数阶段的开始被定义为第一个周期,此后每个周期的荧光增加是连续的,指数阶段结束时,这个增加开始减少;后者以所谓的二阶导数最大值(SDM)为标志[4.].在SDM后,反应进入过渡阶段。

每个反应的PCR效率值是由指数阶段中至少连续三个周期确定的。由于残留基线噪声仍有一些影响,PCR效率是通过对同一目标的单个反应确定的所有PCR效率进行平均计算得出的,这导致每次检测的平均PCR效率变量最小[14.].如最近的回顾,这种方法可以确定PCR效率优于经典使用的标准曲线[3.].

C.问:值或量化周期[2]是达到量化阈值所需的分数循环数(n问:).提供有效的c问:值,量化阈值应放在指数阶段,而C的直接比较问:值要求阈值对运行中的所有反应和测定是相同的[20.].许多qPCR系统将定量阈值设置为噪声在地面相位值的标准偏差的10倍。由于在PCR的第一个周期中有高度可变的噪声,这些阈值在不同的运行之间是不同的,因此不是标准化的。为了使阈值设置标准化,基于网络的LinRegPCR为所有反应的指数阶段的所有检测设置了一个共同的阈值(参见实施)。C.问:每次反应的值在数学上被确定为通过每次反应的指数阶段用直线的阈值的交叉点;与该交叉点对应的循环轴值被报告为C. C问:。虽然共同的阈值允许直接比较C.问:反应之间的值,C问:同样依赖于测定的PCR效率,因此报告C.问:不推荐值[2].

通过解释报告的c导致副通过偏见问:值(3., LinRegPCR报告了效率校正的靶量(N0.)根据量化阈值计算的每次反应,测定的PCR效率和C.问:反应的价值[13.] (无花果。1C)。随着数学易于数学,然后可以使用这些目标量来计算基因表达比率(比率= n0,目标/ N.0,参考)和不同实验条件下基因表达的差异(fold = ratio)实验/比控制)[3.] [21.].

融化曲线分析

大多数QPCR系统可以在放大方案之后进行熔化方案。熔融方案涉及在连续监测荧光的同时逐渐加热反应体积。加热将使双链DNA在其熔化温度(T.m)。当DNA变成单链时,结合的荧光色素被释放,观察到的荧光下降(图。1B,灰色的曲线)。Tm通过不仅通过其长度和GC含量来确定DNA片段,而且通过其序列背景,PCR混合组合物和熔化方案的温度梯度的斜坡速度来确定[16.].为了促进熔化曲线的解释,计算荧光数据的负第一衍生物并绘制温度范围[22.] (无花果。1B,棕色曲线)。在这张图中,每个扩增产物在相关产物的熔化温度(Tm)[17.].观测到的TmTm阳性控制,或先前确定的tm在正确的产品中,能够在正确的放大产品和伪影之间进行歧视。当饱和DNA结合染料时,例如饱和DNA结合染料。使用LcGreen,使用与正确产品的峰相关的荧光可用于去除伪影偏差[17.].

完全熔化的曲线分析涉及数据处理,峰值发现,熔融峰的鉴定,测量与每个峰的荧光和正确产品峰的贡献的计算与总荧光的总峰值相关。但是,大多数情况下,如果不是全部,公司都没有透露他们如何对熔化曲线数据进行分析。没有进入广泛的审查,我们说明了三个例子。BiORAD CFX系统具有用户设置阈值以确定要报告的熔点的最小高度。Roche LightCycler系统使用未公开的方法限制向用户请求的号码报告的峰值数量。ABI棱镜系统具有用户设定温度窗口,其中预期正确放大产品的熔峰,然后通过确定该窗口内外的峰值的峰面积比是否在用户定义的用户上方来评估反应的有效性价值。在所有情况下,系统报告Tm和其他峰值特征,如峰值高度,宽度和区域。没有一个系统对该分析对来自扩增曲线分析产生的报告的定量数据的后果附加。在基于Web的LINREGPCR中,包括无偏透明的熔融峰值分析程序,即没有用户参与峰值发现和识别[17.].用户可以选择从进一步分析中排除相应的反应,并从报告的定量结果中去除人为偏差(N0.)目标。

基于Web的实现

自2003年以来,LinRegPCR已用于QPCR数据分析[6.],2009年的重大更新[13.].这种实现的一个缺点一直是,它只能在Windows环境中使用,并且对于每个不同或更新的qPCR机器导出需要创建一个导入格式。此外,它的性能缓慢,特别是随着qPCR机中平板尺寸的增加,成为一些用户的烦恼。这种缓慢是由于作为LinRegPCR程序核心的图形用户界面。我们并没有从头开始重新设计Windows版本,而是决定将该qPCR扩增曲线分析程序实现一个基于web的版本,通过优化程序代码,将图形界面与数据处理分离,实现平台独立性和更快的性能。作为输入,LinRegPCR使用并利用了RDML文件格式,该格式提供了机器独立的qPCR数据存储和交换。此外,熔化曲线分析已在这一新应用中实现,并集成到报告的定量结果。

实现

扩增曲线分析的实施

分析中的第一和关键步骤是每次反应的基线荧光的准确估计。LinRegPCR版本都以迭代方法确定此基线。最初,基线设置为太高的级别。然后,指数阶段中的数据点被分成两个部分,并且比较了通过子集的直线的斜率。基线估计是逐步降低,直到上半衰的斜率变得比下半半部分的斜率更陡峭,表明基线估计变得太低。然后通过一个步骤增加基线估计,并且步骤减半。迭代该过程,直到斜率小于0.0001;在PCR效率为1.8时,该标准转化为0.0004的效率差异[13.].基线校正因此重建了放大曲线的指数阶段。如果找不到通过指数阶段给出直线的基线值,则报告为基线错误。

分析的第二步是从每个单独反应的线性指数阶段拟合到拟合到数据点的坡度的线的效率值[6.].线性度(W-O-L)的初始高窗设定,并且对于有效反应,各个PCR效率由该W-O-L内的数据点确定。每个测定,计算各个效率的变化系数(CV =标准偏差/平均值),并且W-O-L向下移动直至达到最低CV(图。1A,蓝线之间的周期)。测定的PCR效率是根据这些单独的PCR效率的平均值计算的。对QPCR运行中存在的每个测定进行该过程。在没有放大的反应,总是排除在设置W-O-L之前。默认情况下,也排除了不达到高原的反应;用户可以选择包含它们。

LINREGPCR Web应用程序实现了两种策略以确定和任选地排除的反应,以各种PCR效率从每个测定的平均效率强烈偏离。在Windows版本的LinRegPCR中,用户可以选择使用所有PCR效率或在用户定义范围内排除PCR效率(默认设置±0.05),周围的每个测定效率。然而,这种简单的方法倾向于排除在宽正常分布中的太多反应。为避免这种不需​​要的行为,基于分布偏斜和GRUBB的测试,在这个新版本的LinRegPCR中实现了一种新颖的统计异常检测。由于此可选的异常值排除更改了包含反应的效率的分布,因此迭代W-O-L设置和平均效率计算,直到未发生新的异常值。被认为是效率异常值的反应在结果文件中报告(图。1C)。

放大曲线分析中的最终步骤是调用C.问:值,计算效率修正目标量(N0.)每次反应。这些步骤需要设置量化阈值(图。1A,水平绿线);C.问:值为阈值与放大曲线交点的循环轴位置(图3)。1A,垂直的绿色线)。虽然不建议[2],QPCR文件通常只报告c问:价值观。比较这样的c问:值必须为所有测定设置公共量化阈值。为了可视化目的,基于Web的LINREGPCR在运行中所有反应的指数阶段中设置该常见阈值。为了取消单个PCR效率的随机变化,基于Web的LINREGPCR,确定每次反应从基线校正的荧光值的指数阶段的中心,并且使用测定的平均PCR效率,构建理想的放大曲线然后用来调用c问:反应的价值。附加文件显示放大曲线分析界面[查看其他文件2和分析结果[见附加文件3.].请注意,LinRegPCR的Windows版本为每个检测设置了一个量化阈值[13.[因此,因此,报告的c问:值不能直接比较或在ΔC中使用问:报告[3.21.].

对所有测定的共同阈值的使用不会消除C的偏差问:值是效率依赖的[5.].因此,我们强烈建议报告目标数量(N0.效率校正的值,因此可以在测定和运行之间进行自由比较[3.].LinRegPCR程序计算这些n0.值作为\({n} _ {0} = {n} _ {q} / {e} _ {tar} ^ {{c} _ {q}} \)与常用的量化阈值(N问:),每项检测的PCR效率(E焦油)和c问:每次反应的值[13.].经过扩增曲线分析后,程序根据扩增曲线报告每次反应的目标量以及多项质量措施。另一个文件显示,尽管量化阈值和C问:值,对于两个版本的LinRegPCR来说,每个反应的报告的目标数量相同[请参阅附加文件1].

实现熔化曲线分析

当反应温度逐渐增加时,测量荧光的降低,导致熔化曲线数据(图。1B,灰色的曲线)。这些数据的负一阶导数揭示了一个或多个峰值,其中每个峰值代表熔化温度(Tm)的相关DNA片段(图。1B,棕色曲线)。这些数据的二阶导数提供了关于每一个融化峰宽度的信息。为了去除使一阶导数和二阶导数峰的识别变得复杂的测量噪声,一个良好的不移动峰的位置的平滑算法是必要的[17.].为此,使用了一个简化版的弗里德曼的超级母亲[23.].

平滑后,需要归一化熔融数据以除去温度依赖性但离解无关的荧光减少[22.].在基于Web的LINREGPCR中,用户可以在双线性,指数或组合的标准化方法之间进行选择。双线性归一化方法适用于较低温度范围和较高温度范围的数据点的亚群;然后从低趋势线上的观察到的熔化曲线的高度计算归一化熔化曲线,作为上趋势线和下趋势线之间的差异的比例。指数归一化方法基于在温度范围的开始和结束的给定温度下的熔化曲线的斜率拟合指数函数。组合的归一化方法在指数标准化之后运行双线性标准化[17.].

随后,计算归一化数据的一阶导数和二阶导数,并用于识别熔化峰。峰值位置,或熔化温度(Tm然后,与正确产品的给定熔化温度进行比较,以评估熔融峰是否代表正确的产品(图。1B;垂直黑线)或者如果没有,则与人工制品相关联。熔化曲线分析算法使用RDML文件中给出的预期目标的熔化温度来执行该评估,并在熔化的产品熔化时给出适当的错误和警告消息m鉴定(图。2).当未发现具有预期熔化温度的产品并报告备注,如果检测到多个产品,则该程序发出警告(图。2描述对这些错误和警告的处理)。默认情况下,与目标的预期温度相差1.0°C的熔化温度的峰值被认为代表正确的产品(图。1B;灰色区域)。T的变化m在一项研究中,93个不同的验证靶点和不同的Tm使用相同的反应条件[17.].然而,可接受的温度范围可以独立地调整辨别正确的产品和伪像的辨别性和伪像。Δ峰值高度(在拐点的平均值的负第一导数的最大值)和宽度(拐点之间的温度范围)用于评估峰值质量。如果未达到峰值高度和宽度的预设最小截止,则“峰值”将从进一步的分析中排除。这些截止的截止值设置为Δ峰值高度和5°C峰宽的0.05,并且当负极第一衍生物中的可再现低或宽凸块应该被包括或被排除为峰时,用户可以由用户改变。附加文件显示熔化曲线分析界面[查看其他文件4.及熔化曲线分析结果(见附加文件)5.].在熔化曲线分析之后,该程序报告了每个反应的鉴定的峰以及正确扩增产物峰的总荧光的分数。用户有两个选项:无论是忽略熔化曲线分析的结果,都不建议,或者在放大曲线分析中集成熔化曲线分析的结果。

图2
图2.

插图的流动放大和熔化曲线的分析。在数据处理和分析的不同步骤(矩形框),程序可以检测偏差反应,并提供警告或错误(标签框)。流程图给出了用户如何处理这些警告或如何改进分析以避免将来出现这些错误的建议(圆角框)。请注意,这些建议并非详尽无遗;qPCR检测设计和数据分析的基础知识,以及相关的论文,应该指导用户正确的方向。PC:积极的控制;NC:负控制;Unk:未知样本;

熔化峰分析在放大曲线分析中的集成

除了识别放大伪影的反应外,当伪影被放大时,观察峰中每个熔化峰对总荧光的贡献可用于校正观察的目标量[17.].为此,确定并报告每种观察到的峰值中的荧光,定义为在归一化熔化曲线之间测量的第二衍生物的拐点的倒入熔化曲线之间的荧光损失(图。1d)。正确峰的正确峰对1的总荧光的分数贡献表明,除了正确的产品外,还扩增一种或多种人工制品。当在扩增反应中使用饱和DNA结合染料时,该级分可以用作校正因子以校正C.问:和n0.在显示人工制品放大的反应中发现[17.].因此,熔化曲线分析有助于计算这些反应中的真正目标量。观察到的C校正的应用问:和n0.值在基于Web的LINREGPCR和更正的C中实现问:和n0.在荧光团允许时计算;然后更新存储在RDML文件中的值。校正因子存储在RDML文件中和更正的C中问:和n0.显示值(图。1E,Publication适应)。

通过RDML进行数据导入和错误报告

为了使QPCR数据进行分析,QPCR机器软件尚未基线校正的真正原始荧光数据必须以可读的格式可用。不同的QPCR机器供应商将这些数据与不同格式的文本文件或电子表格表中的一些注释信息一起导出。要提供用于存储和交换QPCR数据的常用数据格式的供应商,RDML格式被引入QPCR字段[24.25.].RDML- tools支持所有RDML版本,并允许在版本之间进行迁移。LinRegPCR应用程序需要RDML 1.1或更高版本。RDML将qPCR信息存储在一个zip压缩的、预定义的xml格式文本文件中。在qPCR数据分析后,RDML支持每次检测的PCR效率和定量阈值的存储以及C问:每次反应的价值和目标数量。熔融温度的注释从版本1.3数字PCR后(http://rdml.org/rdml_v_1_3.html.).在RDML中,用户必须将运行中的每个反应标记为阳性或阴性控制,或未知反应。这些信息允许基于web的LinRegPCR提供智能错误报告。在处理每个反应的放大数据时,该程序会做一些质量检查,这可能导致每个反应报告的警告和错误(图。2).阳性对照无扩增和阴性对照无扩增均为错误报道。警告,即没有扩增,没有平台或偏离PCR效率在不同类型的样品,提请用户注意应通过眼睛评估的反应。然后,用户可以选择排除这些反应,或整个分析,从进一步的分析。这种检查应该包括放大和熔化曲线,而决定应该基于实验的目的和错误结论的后果。例如,阳性对照中“无扩增”的警告在临床诊断中是不可接受的,因为这种情况使从运行中未知样本中没有扩增得出的结论无效;整个qPCR过程必须重复。然而,在未知样本间不同组织的实验研究中,即使阳性对照失败,某些未知样本中同时存在正确产品的扩增也足以接受这些结果。有些错误太严重,以至于程序无法自动计算出目标数量。然而,当用户有理由相信所观察到的C问:值时,用户可以通过使用中报告的值手动计算起始浓度来推翻程序的决定\({n} _ {0} = {n} _ {q} / {e} ^ {{c} _ {q},obs} \)。程序流程的插图(图。2)提供了如何处理在放大和熔化数据处理过程中设置的各种错误和警告的指南。

结果

我们的项目针对两种类型的用户:希望在自己的qPCR实验中分析放大和熔化曲线的湿实验室科学家和创建管道的生物信息学家,以最小的用户参与分析数千个这样的实验。因此,这个基于web的应用程序的功能被拆分为一个用于实际计算的后端RDML-Python库,以及几个可视化数据并提供交互式访问的配套web应用程序。

RDML文件

为了实现qPCR数据的机器独立存储和交换,RDML格式于2009年进入qPCR领域[24.25.].此版本的LinRegPCR基于RDML输入。虽然RDML可免费提供,但并非所有QPCR机器都支持导出到RDML文件。为了分析由这些机器生成的荧光数据,用户需要从从QPCR机器导出的文本文件或电子表格中创建RDML文件。RDML-TableShaper和RDML-Edit工具(参见下文)有助于将各种导出的文件重新格式化为可用于创建RDML文件的常见RDML导入格式。可以在附加文件中找到示例RDML文件[请参阅其他文件6.].

RDML-python图书馆

独立的RDML-Python库(https://github.com/rdml-consortium/rdmlpython.)建立后端处理RDML文件,并执行所有放大和熔化曲线的处理、分析和计算。另一个文件显示了Python库的类设计[参见附加文件]7.].代码是用Python编写的,依赖于NumPy包(https://numpy.org.)的加速数组计算,SciPy包(https://www.scipy.org)用于高级统计计算和LXML包(https://lxml.de)使用C库libxml2和libxslt处理XML文件。RDML-Python库的核心功能可以打开,读取和写入RDML文件并处理RDML格式内的依赖项。基于RDML-Python的LINREGPCR的放大曲线和熔化曲线分析部分被实现为该库中的Callable函数LinRegPCR()和Meltcurveansis()。计算结果将写回RDML文件,如果RDML格式中没有等效元素,则显示为电子表格表。RDML-Python库可以轻松集成到Python程序和生物信息管道中。它还提供有限的命令行界面,可用于分析批量节目中的放大和熔化曲线。

RDML-Tools Web应用程序

RDML-Tools在齿轮上托管,用于分子生物学应用的Web服务器(https://www.gear-genomics.com/rdml-tools/).前端应用程序是为分子生物学实验室地板上的交互使用而设计的。RDML-Tools遵循经典的客户端-服务器架构,使用web应用作为前端调用专用Python服务器,该服务器使用RDML-Python库执行计算。原则上,web应用程序收集输入文件和用户输入,并将这些信息发送给服务器。服务器检查参数并将用户请求转换为对RDML-Python库的调用。一旦计算完成,服务器将结果发送回显示结果的web应用程序,并允许用户探索它们。

www.gear-genomics.com服务器在分析后最多3天存储数据。只有用户可以通过唯一ID在此期间过多数据。但是,用户可以选择在程序“从服务器”链接中的“从服务器上删除的数据从服务器中删除上传的数据”链接之后永久删除其上载数据。RDML-Tools可根据GPL许可证为私有服务器上安装的源分发(https://github.com/rdml-consortium/rdml-tools.),并在下文加以解释。

RDML-Tools帮助

RDML-Tools帮助可以在RDML-Tools页面上找到,它提供了对RDML-Tools的介绍,并提供了关于工具参数及其最佳用法的详细信息。

RDML-validate

XML文件被模式文件绑定到预定义的元素用法。RDML- validate根据正确版本的RDML模式验证RDML文件。该工具将显示一个报告,其中包括使用的RDML版本。如果遇到错误,则给出冲突规则的提示。然后可以使用RDML-Edit(见下面)来纠正错误。

RDML-TableShaper

并非所有QPCR机器导出RDML文件,因此,许多用户留下了无法直接导入RDML-Edit的纯电子表格导出(见下文)。RDML-TableShaper(https://www.gear-genomics.com/rdml-tools/tableShaper.html.)通过加载导出的电子表格并将它们逐步转换为可以导入的格式转换为RDML-Edit以进行进一步编辑和注释来填充差距。如果已知QPCR机器的导出格式,则可以从下拉菜单中选择具有正确参数的文件。否则,必须通过迭代地通过RDML-TableShaper的标签来找到这些参数。完成后,可以保存导入参数以供将来使用。附加文件显示了TableShaper接口的示例[请参阅附加文件8.].

rdml-edit.

RDML文件可以存储多种数据。rdml-edit允许通过专注于文件的选定部分,查看和编辑RDML文件,该部分显示在“活动”选项卡中。为避免意外修改,默认情况下的RDML-Edit仅显示数据。如果edit-mode被激活,则可以修改所有元素,并且可以包含其他信息,除了包含QPCR的原始荧光数据的RDML元素,因为没有有效的原因,更改这些数据。为了使用LINREGPCR应用程序,用户需要使用RDML-Edit和RDML-TableShaper来注释目标,染料,样本,样本类型和反应,当该信息尚未存在于QPCR机器输出中时。为了正常运作,本必须指示样品类型,正面和阴性对照,而不是未知样品是注释的。请注意,RDML-Edit还可以在不同的RDML版本之间进行转换。

RDML-RunView

RDML-Edit将所有信息显示为单个运行。在RDML编辑中选择单个运行后,它将以两种方式在RDML-RunView中可视化。一个视图以有关样本,目标和C的信息,显示了板块铺设问:(如果由QPCR机器调用并导出),则另一个视图将荧光数据显示为图。用户可以在放大和熔化曲线之间进行选择,定制使用的颜色,例如以不同的目标或不同的组织样本区分,并在荧光轴的对数和线性缩放之间切换。附加文件显示Runview界面的示例[请参阅其他文件9.].

RDML-LinRegPCR

RDML-LINREGPCR促进了单个QPCR运行的放大和熔化曲线数据的可视化和分析。用户界面类似于RDML-RunView,用于显示RDML文件的内容或放大曲线分析和熔化曲线分析选项卡的分析结果。放大曲线分析选项卡允许(重新)计算C.问:使用LINREGPCR算法的值。结果显示在电子表格表中,突出显示异常反应。如果是双击一行,则在与线性窗口补充的Runview选项卡中突出显示相应反应的放大曲线,以及量化阈值和C的值问:。熔化曲线分析标签显示熔融曲线分析的结果。放大曲线分析和熔化曲线分析接口的屏幕截图显示在附加文件中[请参阅附加文件25.].电子表格中的结果可以保存为CSV文件,也可以导出到Microsoft Excel或Libre Office Calc等程序中,用于计算基因表达率、实验和统计分析之间的倍数变化。图形可以导出为SVG,粘贴到演示程序中,比如PowerPoint,或者在矢量程序中进行修改,比如Impress和Inkscape。数字1使用iNKScape从如此导出的SVG文件创建了A,B。数字1在导出为CSV文件的分析选项卡上编辑了C-E的示例。

讨论

大多数qPCR机软件并不能提取扩增曲线中存在的所有相关信息。因为达到量化阈值往往足以认为一个反应是积极的,这也导致了C的分配问:低质量反应的价值。尽管这类反应的结果可能与临床诊断有关,但它们不应用于定量目的,因为低质量往往与非常低的PCR效率相关[3.].在LinRegPCR中实施的扩增曲线分析在每个反应中提供了定性和定量细节,从而能够检测偏离反应,测定和运行。由于LineRegPCR的基线估计基于指数阶段中的数据点并且不使用PCR的早期循环,因此不受随机地相噪声的影响。这种独特的基线估计算法可以解释为什么LINREGPCR在放大曲线分析方法的比较中具有最低变化和最高再现性的QPCR导致QPCR结果[14.].

呼叫c问:单个反应的价值,LINREGPCR Web应用使用每个测定的平均PCR效率。这样做,报告的c问:值不受残余随机基线噪声的影响。虽然LinRegPCR报告C问:从每个运行的公共量化阈值调用的值,这将允许直接比较c问:值,不建议这样做。因为c的依赖问:在PCR效率上,从ΔC中得出结论问:值可以严重偏见[23.5.].只能在研究之间进行比较和转载效率校正的QPCR结果。

默认情况下,LinRegPCR使用PCR效率计算每个反应的目标量。每次分析的效率计算为每次分析中观察到的单个反应的PCR效率的平均值。将单个反应的PCR效率报告在输出表中,不仅可以作为质量标准,而且该PCR效率值还可以用来计算单个反应的起始浓度。后一种选择通常出现在临床现场分析中,在这种情况下,样品纯化可能不太理想,甚至不存在,而且样品污染可能影响PCR效率。在这些情况下,样品之间的PCR效率的差异不允许计算每个检测可靠和有意义的PCR效率[3.].因为LinRegPCR报告C问:单个反应在输出中的价值和PCR效率,使用者可以使用报告的值手动计算单个反应的起始浓度。

尽管许多研究人员不知道熔化曲线分析的存在,但该分析应被认为是QPCR分析中的重要步骤,特别是当使用DNA结合染料来监测PCR时。熔化曲线分析允许除了预期目标之外的伪造型材,这在琼脂糖凝胶上的大小分离方便,易于,快速,便宜,更敏感[16.17.].图中的例子。1A,B显示与具有75%伪影和25%正确扩增子的人造混合物的输入相同的反应。放大曲线是完美的,通过所有质量控制,并不会被拒绝(图。1一种)。只有熔化曲线分析揭示了伪影的存在(图。1并向用户提供错误警告。这个例子表明,当研究人员没有识别和排除合成人工制品的反应时,报告的量化结果是没有意义的。

这个新版本的LinRegPCR包括一个独立于用户的熔化曲线数据分析,并报告所有观察到的熔化峰值。该程序使用RDML输入中给定的熔化温度来识别预期放大目标的峰值。为此,用户必须从正对照样品的初步研究中确定熔化温度。在经过验证的PCR检测中,阳性对照应仅显示一种产物的扩增。熔化曲线分析主要用于确定在未知样品中是否放大了正确的产品、人工制品或两者。通常,放大人工制品的反应被排除在进一步的分析之外。然而,我们最近表明,扩增曲线分析的结果可以通过确定正确的峰对总荧光的贡献来校正[17.].这意味着,基于熔化曲线分析,在还放大(A)人工制品的反应中,可以正确地量化预期的目标。实施该校正意味着这些反应不再被丢弃并且不会从研究中丢失。只有当使用饱和DNA结合染料,如LCGreen,才能使用后一种校正[17.].

何时使用linregpcr程序?LinRegPCR中的扩增曲线分析可用于分析来自所有放大监测模态产生的QPCR数据[26.].熔化曲线分析需要DNA结合染料或杂交探针,它们与双链DNA结合并在加热过程中释放[16.].故选C问:或者N0.熔融曲线结果要求观察到的荧光来自饱和染料[17.].

如何使用此程序的结果?使用LINREGPCR分析QPCR数据的主要结果是目标数量(n0.)每次反应,每次运行量化阈值计算,PCR效率每测定和C.问:每次反应的值。这些目标量代表每个反应的基因表达,并且可用于计算靶和参考基因之间的基因表达比(比率= N.0,目标/ N.0,参考基因)和实验条件下的折差(折=比)实验/比控制).在分析扩增曲线后,注释结果(每个测定和C的效率问:每个反应)存储在RDML文件中。这些分析结果可以进一步分析像QBase这样的专业节目[27.或导出到Excel以进行额外的计算、演示和统计分析。

如上所述,此涉及此Python的LinRegPCR版本的所有工具都是开源,工具可以自由使用。算法的实现是透明的,可以通过用户的要求扩展。RDML-Python库可根据MIT许可证作为源分发(https://github.com/rdml-consortium/rdmlpython.)或作为“RDMLPython”包使用PIP3。在实现此基于Web的LINREGPCR的不同功能期间,在Windows版本LinRegPCR中也进行了一些更改。这些变化不会影响Windows版本报告的目标数量。虽然不同的量化阈值导致不同的c问:值,在网上LinRegPCR释放时,报告的靶量(N0.)是相同的程序版本[见附加文件1].虽然报道的c问:值是基于一个共同的阈值,我们不建议直接比较这些C问:不考虑PCR效率的值[3.] [21.].基于网络的LinRegPCR是独立于平台的,其处理时间大约是Windows版本的6倍。网络版本的警告和错误报告,部分基于RDML输入文件中的信息,更广泛,具有异常PCR效率的反应,无需用户输入,通过统计评估来识别。熔化曲线分析的集成允许自动识别和排除反应,其中的人为因素被放大。在基于web的LinRegPCR发布后,Windows版本将继续可用,并支持其使用。然而,它将不再更新。

结论

开发了基于Web的LinRegPCR版本,以克服原始程序的放大曲线分析的局限性[6.13.]融化曲线分析[17.].除了加工速度的显着增加之外,这些分析程序的Web实现提供了平台独立性。通过纳入统计异常检测选项和熔化曲线分析的集成,这种新版本的LinRegPCR是一种综合分析工具,用于分析QPCR数据,导致定量结果以及基于放大和熔化曲线数据的质量检查。分析结果存储在RDML文件中,并以可以导出进一步分析的电子表格格式汇总。类似地,图形可以以允许在其他程序中轻松格式化的向量图形格式中导出图形。

可用性和要求

  • 项目名: RDML-Tools

  • 操作系统):平台独立

  • 编程语言: Python, Java脚本

  • 其他需求:numpy,scipy,lxml,烧瓶

  • 执照:GPL-3.0(RDML-Tools),MIT(RDML-Python库)

  • 非学者使用的任何限制: 没有任何

可用性数据和材料

本研究中产生或分析的所有数据均包含在本文及其补充信息文件中。当前研究中提供的应用程序的源代码可以在rdml联盟存储库中获得,https://github.com/RDML-consortium

缩写

QPCR:

定量聚合酶链反应

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

C问:

量化周期

ΔC问:

两个c之间的差异问:价值

N问:

量化阈值

N0.

起始浓度或目标量

E:

PCR效率

W-O-L:

线性窗口

T.m

熔化温度

RDML:

实时PCR数据标记语言

SDM:

第二衍生最大值

简历:

变异系数

参考

  1. 1。

    Wittwer CT,Herrmann Mg,Moss AA,Rasmussen RP。快速循环DNA扩增的连续荧光监测。生物技术。1997年; 22(1):130-8。

    CAS.文章谷歌学术搜索

  2. 2。

    Bustin Sa,Benes V,Garson Ja,Hellemans J,Huggett J,Kubista M,Mueller R,Nolan T,Pfaffl MW,Shipley Gl,等。MIQE指南:公布定量实时PCR实验的最低信息。Clin Chem。2009; 55(4):611-22。

    CAS.文章谷歌学术搜索

  3. 3.

    Ruijter JM,Barnewall RJ,Marsh IB,Szentirmay An,Quinn JC,Van Houdt R,Gunst QD,Van Den Hoff MJB。准确QPCR分析和报告需要效率校正。Clin Chem。2021; 67(1):829-42。

    文章谷歌学术搜索

  4. 4.

    Rasmussen R.在灯芯仪器上定量。在:Meuer S,Wittwer C,Nakagawara K,编辑。快速循环实时PCR:方法和应用。海德堡:斯普林克;2001. p。21-34。

    谷歌学术搜索

  5. 5.

    pfaffl mw。实时RT-PCR中相对量化的新数学模型。核酸RES。2001; 29(9):45E-45。https://doi.org/10.1093/nar/29.9.e45

  6. 6.

    Ramakers C, rujter JM, Lekanne Deprez RH, Moorman AFM。定量实时聚合酶链反应(PCR)数据的无假设分析。>。2003;339(1):62 - 6。

    CAS.文章谷歌学术搜索

  7. 7.

    赵胜,王志强。实时定量聚合酶链反应的综合算法。计算机生物学杂志。2005;12(8):1047-64。

    CAS.文章谷歌学术搜索

  8. 8.

    Tichopad A,Dilger M,Schwarz G,Pfaffl MW。从单一反应设置中标准化测定实时PCR效率。核酸RES。2003; 31(20):E122-122。https://doi.org/10.1093/nar/gng122

  9. 9.

    Peirson Sn,Butler Jn,Foster RG。对定量实时PCR数据分析的新颖和常规方法的实验验证。核酸RES。2003; 31(14):E73-73。https://doi.org/10.1093/nar/gng073

  10. 10。

    Lievens A,Van Aelst S,Van Den Bulcke M,Goetghebeur E.使用可变效率模型来提高实时PCR数据的分析:FPK-PCR。核酸RES。2012; 40:E10-E10。https://doi.org/10.1093/nar/gkr775

  11. 11.

    Rutledge RG, Stewart D.用于确定扩增效率的方法的关键评价驳斥了实时PCR的指数特性。BMC Mol Biol. 2008;9:96。

    文章谷歌学术搜索

  12. 12.

    采用不对称参数对实时PCR数据进行高度精确的s形拟合。BMC Bioinform。2008;9:221。

    文章谷歌学术搜索

  13. 13。

    Ruijter JM,Ramakers C,Hoogaars WMH,Karlen Y,Bakker O,Van Den Hoff MJB,Moorman AFM。扩增效率:在定量PCR数据分析中连接基线和偏差。核酸RES。2009; 37(6):E45-E45。https://doi.org/10.1093/nar/gkp045

  14. 14.

    Zhao S, Spiess AN, Boggy G, Blom J, Rutledge RG, Sisti D, Lievens A, De Preter K, et al.;qPCR曲线分析方法对可靠生物标志物发现的评价:偏倚、分辨率、精密度和意义。方法。2013;59:32-46。

    CAS.文章谷歌学术搜索

  15. 15.

    Ruiz-Villalba A, van Pelt-Verkuil E, Gunst QD, rujter JM, van den Hoff MJ。定量聚合酶链反应(qPCR)中非特异性产物的扩增。Biomol Detect Quantif. 2017; 14:7-18。

    CAS.文章谷歌学术搜索

  16. 16.

    Ririe Km,Rasmussen RP,Wittwer CT。通过分析聚合酶链反应过程中DNA熔化曲线的产品分化。肛门生物化学。1997年; 245(2):154-60。

    CAS.文章谷歌学术搜索

  17. 17.

    rujter JM, Ruiz-Villalba A, van den Hoff AJJ, Gunst QD, Wittwer CT, van den Hoff MJB。使用DNA熔化曲线分析去除qPCR结果中的人为偏差。美国实验生物学学会联合会j . 2019; 33(12): 14542 - 55。

    CAS.文章谷歌学术搜索

  18. 18.

    康塔尼斯。实时PCR扩增效率的评估,以检测PCR抑制剂。法医学学报。2006;51(4):795-804。

    CAS.文章谷歌学术搜索

  19. 19.

    实时荧光定量RT-PCR数据分析:现有概念和新的“基因表达的C (T)差异”公式。中华医学杂志。2006;84(11):901-10。

    CAS.文章谷歌学术搜索

  20. 20。

    Nolan T,双手Re,Bustin Sa。使用实时RT-PCR定量mRNA。NAT PROTOC。2006; 1(3):1559-82。

    CAS.文章谷歌学术搜索

  21. 21。

    Ruiz-Villalba A, rujter JM, van den Hoff MJB。qPCR数据分析和报告中Cq的使用和误用。生活(巴塞尔)。2021; 11(6): 496。

    谷歌学术搜索

  22. 22。

    怀特沃市R宫高分辨率DNA熔化分析的数学算法。方法Enzymol。2009;454:323-43。

    CAS.文章谷歌学术搜索

  23. 23。

    弗里德曼农协。变量跨度顺畅。1984.https://doi.org/10.2172/1447470

  24. 24。

    Lefever S,Hellemans J,Pattyn F,Przybylski Dr,Taylor C,Geurts R,Untergasser A,Vandesompele J. RDML:结构语言和实时定量PCR数据的报告准则。核酸RES。2009; 37(7):2065-9。

    CAS.文章谷歌学术搜索

  25. 25。

    rujter JM, Lefever S, Anckaert J, Hellemans J, Pfaffl MW, Benes V, Bustin SA, Vandesompele J, Untergasser A. consortium R: RDML-Ninja和RDMLdb用于qPCR数据的标准化交换。BMC Bioinform。2015;16:197。

    文章谷歌学术搜索

  26. 26.

    Ruijter JM,Lorenz P,Tuomi JM,Hecker M,Van Den Hoff MJ。用于QPCR的不同荧光报道的荧光增加动力学依赖于监测化学,靶向序列,DNA输入类型和PCR效率。Mikrochim Acta。2014; 181(13-14):1689-96。

    CAS.文章谷歌学术搜索

  27. 27.

    Hellemans J,Mortier G,De Pa,Speleman F,Vandesompele J.Qbase相对量化框架和软件,用于管理和自动分析实时定量PCR数据。基因组Biol。2007; 8(2):R19。

    文章谷歌学术搜索

下载参考

确认

作者感谢AXEL J. J.Van Den Hoff为他的帮助测试了测试早期版本的程序和他对Web应用程序的界面的宝贵评论。他们还感谢Jaco Hagoort的帮助,让AU访问Windows版本的LinRegPCR的源代码。作者感谢Robias Rausch为高级编程建议和Markus Hsi-Yang Fritz进行着陆页App App Build基础架构。

资金

不适用。

作者信息

隶属关系

作者

贡献

JMR和AU编程的基于Web的LINREGPCR。AU创建了RDML-Tools。MJBVDH执行了QPCR实验,并提供了测试运行的样本数据。vb运行服务器基础架构。所有作者分析了数据并优化了底层算法。所有作者都写了稿件。所有作者阅读并认可的终稿。

相应的作者

对应于Andreas Untergasser或者莫里斯·j·b·范登霍夫

伦理宣言

伦理批准和同意参与

所有DNA材料都是从由中央委员会动物实验所授予的项目许可证收集的小鼠,并由阿姆斯特丹UMC的动物实验委员会批准,该动物实验委员会,地址AMC。

同意出版物

不适用。

利益争夺

AU和JMR是非营利性RDML-Consortium的成员。MJBVDH和VB声明他们没有竞争利益。

附加信息

出版商的注意

欧宝体育黑玩家Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。

补充信息

额外的文件1。

Excel文件将新Python的输出与原始Windows LinRegPCR版本进行比较。还说明螺旋轴。

额外的文件2。

LinRegPCR web界面截图,显示扩增曲线分析RunView页签。

额外的文件3。

LINREGPCR Web界面的屏幕截图显示具有扩增分析结果的LINREGPCR标签。

附加文件4。

MeltCurveAnalysis web界面的截图,显示熔化曲线分析RunViewtab。

附加文件5。

屏幕截图的熔体脉冲网界面,显示熔融曲线分析的熔体尿动分析标签。

附加文件6。

此文件包含RDML格式的示例放大和熔化曲线数据。

附加文件7。

RDML-Python库中定义的类概述..

附加文件8。

屏幕截图的TableShaper web界面显示了一个转换表格spreadsheett RDML格式的示例。

附加文件9。

RunView web界面的截图,显示了带有反应注释的板块布局和对数荧光尺度上的原始荧光数据。

权利和权限

开放访问本文根据创意公约归因于4.0国际许可证,这允许在任何中或格式中使用,共享,适应,分发和复制,只要您向原始作者和来源提供适当的信贷,提供了一个链接到Creative Commons许可证,并指出是否进行了更改。除非信用额度另有说明,否则本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创造性公共许可证中,除非信用额度另有说明。如果物品不包含在物品的创造性的公共许可证中,法定规定不允许您的预期用途或超过允许使用,您需要直接从版权所有者获得许可。要查看本许可证的副本,请访问http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。Creative Commons公共领域奉献豁免(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)适用于本文中提供的数据,除非另有用入数据的信用额度。

再版和权限

关于这篇文章

通过CrossMark验证货币和真实性

引用这篇文章

Untergasser, A., rujter, j.m., Benes, V.;等等。基于Web的LINREGPCR:用于可视化和分析(RT)-QPCR扩增和熔化数据的应用。欧宝娱乐合法吗22,398(2021)。https://doi.org/10.1186/s12859-021-04306-1

下载引用

关键词

  • LinRegPCR
  • RDML
  • qPCR
  • PCR.
  • 放大曲线
  • 融化曲线