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一种新的自动图像分析管线,用于量化培养的人细胞内质网的形态学变化

摘要

背景

在哺乳动物细胞中,内质网(ER)由高度复杂的网状形态组成,分布在细胞质中。这个细胞器是生物学家特别感兴趣的,因为它的功能障碍与许多疾病有关,这些疾病往往表现为网状网络的结构和组织的变化。由于其复杂的形态,图像分析方法定量描述这一细胞器,重要的是任何改变,缺乏。

结果

在这项工作中,我们详细介绍了一种方法学方法,该方法利用自动高含量筛选显微镜来捕获各种ER标记的荧光标记细胞图像,然后进行定量分析。我们提出两个关键指标,即密集ER的面积和网状元素之间多边形区域的面积,分别为测量粗糙ER和光滑ER的数量提供了基础。我们证明,在我们的自动图像分析管道中,可以定量测量和比较ER的许多不同药理干扰。此外,我们还表明,该方法可以在商业和开放存取图像分析软件中实现,结果相当。

结论

我们建议,这种方法在大规模的遗传和化学干扰的背景下,以评估贴壁细胞培养的ER的组织要应用的潜力。

背景

在图像分析领域之一显著挑战是图像的以允许大约在井或组织的单个细胞容易量化的信息的方式来获取。在这方面,在图像的手动评估,自动分析提供了许多优点,因为它是客观的,可再现的,并且显著更少劳动密集的,从而实现了大的数据集的分析中的一小部分时间[1.].然而,图像分析的逻辑顺序步骤的设计,所谓的自动分析管道,使用商业和开放访问软件(如Harmony®、CellProfiler [2.]),取决于所研究的表型可以是直接的。在大多数图像分析管道中,核是识别的主要细胞器,因为它是每个电池的大,球形或卵形,单拷贝的细胞器,其基本几何特征如长度(长轴),宽度(短- 可以容易地提取区域,周边和圆形度。下一步是鉴定细胞血浆膜,其又提供了关于细胞质的位置的信息。在这些步骤之后,大多数图像分析策略然后专注于识别细胞质中感兴趣的细胞器或亚细胞结构,并实施适当的分析和量化常规[3.].细胞器显示出高度的形态多样性,正是在这一阶段,图像分析管道出现分歧,以便应用最合适的方法来识别它们。例如,尽管高尔基复合体通常也是哺乳动物细胞中的单个细胞器,但其外观可能具有高度异质性然而,越来越复杂的图像分析程序现在能够报告在这种细胞器中看到的各种表型,以应对各种干扰[4.,5.].同样,近年来,在显示点状和管状形态的其他细胞器(如核内体)的自动检测和分析方面也取得了良好的进展[6.].甚至甚至均匀剖析了允许分析细胞器裂变和融合事件的生物细胞中的探讨也是可能的[7.,8.].尽管有了这些进展,但高度动态和形态复杂的内质网(ER)网络仍然是使用自动图像分析方法进行分析的一个重大挑战。因此,尽管越来越多的文献将ER形态与人类疾病联系起来,但目前缺乏可用的ER形态定量分析工具[9,10.].

ER是由片状和小管组成的网状结构,从核膜一直延伸到质膜。尽管管腔空间保持连续性,内质网仍然高度分隔,包括核膜(NE)、布满核糖体的“粗糙”内质网(RER)和光滑内质网(SER)小管[11.,12.,以及称为ER出口位点的专门区域,它们在分泌转运的第一步中起关键作用[13.].每个细胞室执行基本但不同的细胞功能,如RER的蛋白质合成和折叠,SER的钙储存、脂质代谢和线粒体分裂[14.].ER车厢也不同结构。的RER包括延伸过许多微米的小曲率,它们在弯曲边缘离开50个纳米厚的内腔密封两个平行的脂质双层。这些片材通常是层叠,由扭曲的膜的区域和螺旋边缘[连接15.].相比之下,SER包括具有直径范围从25至90纳米的小管,其是由创建正曲率[ER-成形蛋白稳定16.,17.,18.].

在有丝分裂后的细胞内,内质网的排列使得内质网位于细胞核和高尔基体的近端,而丝氨酸管状网络占据核周区域并向细胞周围延伸[19.,20.].然而,ER组织是动态的,可以根据细胞的生理条件而改变。例如,在有丝分裂期间,ER通过薄片到小管的相互转换和NE的分解而经历一次完整的重组[21.,22.].ER常驻蛋白质的改变可用性,细胞骨架蛋白或磷脂也可以改变ER小管和ER板之间的平衡[19.,23.,24.,25.].维护er组织对于维护er的基本职能至关重要[11.].内质网形态的改变已经在几种病理条件下被报道过,例如(1)在病毒感染期间,病毒会利用宿主细胞膜进行复制,在许多情况下,通过与内质网蛋白的相互作用重塑内质网膜,创造所谓的复制工厂(RFs),促进病毒复制所必需的细胞和病毒成分的富集[26.,27.];(2)蛋白质聚集体的存在,许多神经变性疾病的标志,通过增加的外围ER薄片的存在增加了ER组织的改变[28.,29.];(3)通过损害的蛋白质清除缺陷通过损伤的抗体降解,或在囊性纤维化细胞中积聚粘贴的蛋白质的累积,结果膨胀ER元素[30.,31.]; (4) 几种化学物质的细胞毒性作用与内质网结构的变化有关[32.,33.,34.,35.,36.,37.];和(5)内质网形成蛋白的突变,已知会导致神经退行性疾病,如遗传性痉挛性截瘫(HSPs),已在体外和体内模型中证明会破坏内质网的组织[24.,38.,39.,40].

尽管ER组织在蜂窝功能和功能障碍中明确的重要性,但是ER构象可靠和可重复量化的图像分析工具非常有限。已发布的报告主要依赖于对ER结构变化的定性描述,同时在大多数模型系统中,er组织的变化的量化是稀缺的或缺席的[26.,29.,41.,42.,43.].最近,开发了一套工具,能够量化植物细胞中的ER网络[44.].鉴于ER是一种单一的细胞器,具有在细胞健康和疾病中具有重要作用的单一副本细胞器,需要建立用于在培养的哺乳动物细胞中描述这种复杂的细胞器的客观工具,这些工具将允许研究人员在不同的情况下检测其组织的变化状况。在这项研究中,我们描述了ER组织自动分析的高内容平台的设计。我们使用该平台研究遗传和化学改性剂对依赖细胞培养物组织的遗传和化学改性剂,证明其在各种细胞基测定中更广泛使用的鲁棒性和适用性。

结果

高内容和高分辨率成像策略可视化内质网

下游图像分析的成功实现依赖于输入图像的质量和一致性,因此第一步是优化我们的成像协议,使其允许随后的缩放。因此,设计在96孔光学透明板中,与装有63×/ 1.15A na水浸物镜的全自动共聚焦高含量筛选显微镜相容(图。1.一种)。该实验装置旨在确保所有在整个实验中均未置换的所有成像条件,并且与大规模遗传扰动或化学筛查的潜在升级相容。高分辨率成像中的一个主要瓶颈与高分辨率显微镜相结合是数据累积[1.].为了减轻这个问题,我们对1.53毫米的中心地区进行了抽样2.在每个孔中(图。1.b)确保我们每孔捕获至少50-100个细胞,这是一种通常被认为足以从用63×物镜获取的图像进行准确的高含量分析(图。1.C)。我们接下来考虑了最相关的细胞模型,可以为er开发图像分析管道。我们最初选择了U-2 OS细胞,因为这些细胞具有大而平坦的形态,具有广泛的RER和SER网络在整个细胞质中扩散(图。1.D) (45.].具体来说,我们使用稳定表达ER标记物Sec61β-mEmerald的U-2 OS细胞系[33.].该标记为Ser管道和Perinuclecle RER定位,提供了强烈的信噪比(图。1.D),且其外源性表达不影响ER动力学,因为Sec61β蛋白的微管结合位点被其与荧光蛋白mEmerald的融合所阻断[46.].将这些U-2 OS细胞镀成96孔板的孔,并使用63×/ 1.15 na水浸物镜进行第二天成像,实现了0.28μm的有效XY分辨率,这使能外围SER小管的可视化和细胞核区域中的密集ER结构(更亮)(图。1.尽管U-2 OS细胞具有很强的粘附性,因此它们的细胞质和细胞器在几乎只有二维的情况下横向延伸超过几微米,但它们仍然有一个小程度的深度,这可能导致仅在分析单个光学切片时无法检测到连续的ER小管。为了克服这个问题,我们确定最佳实践是拍摄几个z平面,以跨越细胞外围的深度,然后使用这些切片的最大投影作为分析的输入图像(图。1.F)。这种方法还有助于消除焦点伪造。

图1
图1

自动化的高内容/高分辨率成像工作流。A.使用自动旋转盘共聚焦显微镜对96孔微孔板进行成像,具有63×水浸泡物镜。B标准0.32 cm中存在的成像场(网格)总数2.一个96孔板(黄色)的孔,包括7×7个字段的成像区域。C放大7 × 7含有稳定表达内质网标记物Sec61β-Memerad(绿色)的U-2 OS细胞和用Hoechst 33342(蓝色)染色的细胞核的成像区域。比例尺 = 200μm。D放大的单成像字段。秤条=50μm。E成像场的放大区域,显示使用63 × 目标。比例尺 = 5μm。F图像对应于以0.5 μm间隔排列的5个共焦平面的最大强度投影

开发的分析工作流程总结在图1中。2.并举例说明所遵循的原则。第一步是自动细胞分析的标准步骤,包括细胞分割(图)。2.B),并且基于核性质过滤细胞群以去除分割和凋亡细胞(图。2.C)。因为我们用一个稳定表达的细胞系的工作,我们也包括一个过滤器的步骤,以去除已经失去任何外源DNA的质粒或只弱表达它(图细胞。2.d)。我们首先使用Harmony®图像分析软件进行了分析,用于获取图像的自动显微镜的定制分析软件,因为该软件允许轻松拼接多个字段。但是,为了证明我们的分析方法不限于此软件,我们应用了相同的原则并在CellProfiler中重建了类似的分析管道[2.]使用各个字段的最大投影图像(附加文件1.:图S1)。一旦所有单个细胞被分割和过滤,我们接下来构建图像分析步骤来量化ER组织,特别是SER多边形的面积和核周密集ER的比例(详见下面)。

图2
图2.

ER分析管道工作流程和初步步骤。A.分析流水线工作流程摘要。ROI:兴趣区域。PM:血浆膜B7×7成像字段的分割示例(左);鉴定单个细胞和细胞区:核,PM和细胞质(右)。秤条=200μm。C基于核形态学和强度特性的过滤器。(左)细胞组,显示用Hoechst 33342染色的核。(右)过滤细胞(绿色)和丢弃的细胞:分开细胞(红色)和多核细胞(蓝色)。秤条=50μm。D基于细胞质内质网标记物(Sec61β-Memerad)强度的过滤器。(左)显示用Sec61β-Memerad标记的内质网的细胞组。(右)过滤细胞(绿色)和丢弃的未转染细胞(红色)。刻度条 = 50μm

SER多边形区域的定义

SER小管在多边形阵列中形成网络,其中的“间隙”称为多边形区域[47.].SER小管以三向连接互连,从而创建SER网络的节点。在表达SEC61β-MENORALD的U-2 OS细胞中清楚地看到这种形态(图。3.A).先前的一项研究报道,在过表达三路连接蛋白Lunapark后,每个膜表面的三路连接数量增加,形成一个具有较小多边形的密集分支网络[39.].假设ER功能的其他干扰可能会改变三叉结的数量和SER网络的密度,我们探索了使用多边形区域大小作为细胞周围SER网络密度的读出。管状SER网状多角形从核周RER延伸,通过细胞外周到达质膜[12.,48.].In order to quantify the area of these ER polygons, we first defined the cell periphery as a new region using the Harmony image analysis ‘building block’ termed “select cell region”, which performs radial calculations to shrink the cytoplasm, pushing the inner border (nuclear border) towards the cell perimeter depending on the distance between the two, resulting in a new a ring-shaped area which defines our region of interest (ROI) (Fig.3.B,蓝色,附加文件2.其他软件包包括重新定义区域的替代构建块,例如在CellProfiler中,我们使用“对象处理”来“收缩”对象“细胞”,并通过从对象“细胞质”中减去这个修改过的区域来识别“第三对象”,识别出一个名为“ROI”的新对象(附加文件1.:图。S1C,附加文件2.:附录2)。在定义的ROI中,我们接下来使用SEC61β-MEMERDD信号来检测ER小管,从而形成ER网络的掩模'(图。3.C,绿色;附加文件1.:图。S1C)。通过反转ER掩模,我们获得了由ER小管和细胞周边有界限的区域(图。3.d,分别黄色和蓝色;附加文件1.:图。S1C)。作为ER和细胞周边之间的区域(图。3.D,蓝色)不代表真正的ER多边形,这些被过滤区域与细胞周长重叠排除。通过这种方法,我们能够将ER小管包围的细胞质区域定义为多边形(图。3.D、 黄色;附加文件1.:图。S1C)可以通过软件分析,以及诸如每个电池的平均面积(图。3.E) 这条管道使我们能够筛选管状SER网络的化学或遗传修饰物。

图3
图3.

SER多边形区域的定义。广告在相同的U-2 OS单元和小区的放大区域上显示的分析中的顺序关键步骤。放大图像上的尺度条=20μm和5μm。A.U-2 OS细胞表达ER标记物Sec61β-mEmerald(白色)。B细胞质感兴趣区(ROI)外围环形区域的定义。C掩蔽ER小管(绿色)将阈值施加到ROI内的SEC61β-MEMERDD信号。DER的反演掩模导致检测ER和检测到质膜(蓝色)之间的内部的多边形区域(黄色)和区域。E步骤A和D显示在一组细胞中。秤条=50μm

核周致密RER结构的定义

核糖体镶嵌的RER由通常位于Perinuclecle Cella区域中的一系列相互连接的堆叠片组成[12.,48.]尽管共焦显微镜无法分辨内质网亚结构,但我们能够清楚地观察到核周细胞区域的Sec61β-膜强度高于细胞周围区域(图。4.A) .伪彩色图像上ER标记强度的差异分布变得更清晰(图。4.B) 高强度像素颜色为黄色或橙色,低强度像素颜色为粉色、紫色或蓝色。如前所述,高强度Sec61β荧光的核周区可能对应于内质网所在的区域,而外周区对应于管状内质网。应用强度阈值,我们生成了一个大致对应于致密RER的掩模(图。4.C,黄色;附加文件1.:图S1D)。一旦创建了这个区域的蒙版,我们就会计算单元区域与它重叠的像素比例(图。4.D;附加文件1.:图S1D)。通过这种分析,我们可以计算出细胞内RER的比例(图。4.E),并确定在化学或基因修饰剂的处理下,ER的这个子室是如何改变的。

图4
图4.

Perinuclear致密RER结构的定义。广告在与图2中的相同U-2 OS单元上显示的分析中的顺序关键步骤。2..比例尺= 20 μm。A.表达内质网标记物Sec61β-膜的U-2 OS细胞(白色)。B基于Sec61β-mEmerald信号强度的伪彩色图像,暖色(红色、橙色、黄色)代表较高的信号强度,冷色(粉色、紫色、蓝色)代表较低的信号强度。C在细胞质(ROI)内将强度阈值施加强度阈值(ROI)后施加强度阈值后的密集ER(黄色面积)。D黄色区域为细胞质表面,白色部分被致密的内质网所占据。E步骤A和D显示在一组细胞中。秤条=50μm

药物诱导的U-2 OS细胞重组

一些研究报告了不同化合物对内质网结构的改变[32.,37.,49.]然而,所有这些研究的一个局限性是,它们采用定性分析,无法客观描述观察到的变化。相比之下,我们开发的分析管道允许对药物治疗后培养细胞内质网组织的变化进行无偏量化。我们首先应用ur图像分析输送至表达Sec61β-Memerad的U-2 OS细胞,并量化SER多边形和致密RER的稳态区域(图。5.)。这些值为我们提供了所有后续实验的基准值。有趣的是,当我们在另一种细胞系中重复这些实验时,瞬时表达相同的SEC61β-MEMELDD蛋白,我们为SER和RER区域获得的值高度可比(附加文件1.:图。S2)。这表明我们的图像分析策略不仅限于从U-2 OS细胞进行测量。为了验证我们的管道还可以检测ER组织的改变,我们处理了表达SEC61β-MEMERDD的U-2 OS细胞,这些药物据报道扰乱ER。在用饱和脂肪酸棕榈酸(250μm持续16小时)或霉菌毒素细胞蛋白B(10μm持续30分钟)处理后,与未处理的或DMSO载体对照相比,U-2 OS细胞显示出显着较大的多边形区域(图。5.a,b)表明SER网络变得越来越密集。相比之下,用V-ATP酶抑制剂BafiLomycin A1(50nm持续16小时)的处理导致显着较小的SER多边形(图。5.A,B,附加文件1.:图。S3)和致密RER的膨胀(图。5.A、 C,附加文件1.中:图S3)指示在整个细胞中的ER网络的密度的增加。有趣的是,已知药物诱导ER应激反应,毒胡萝卜素(100nM的16小时),并衣霉素(500nM的16小时)在由所提供的分辨率不导致统计学显著改变至ER网络的组织,至少共聚焦荧光显微镜(图5.)。

图5
图5.

药物诱导U-2 OS细胞内质网重组。A.在用载体(DMSO),Thapsigargin,undicamycin,棕榈酸,细胞蛋白B和Bafiolomycin A1处理后,在u-2 OS细胞中表达Sec61β-Memerald的u-2 OS细胞中的ER(绿色)分布的代表性图像。看到多边形区域被扩大(在放大图像中的红色箭头)或收缩(放大图像中的黄色箭头)。核(蓝色)。秤条=20μm顶行图像和10 =μm的放大图像。BER多边形区域平均大小的量化。C细胞质中致密内质网百分比的定量。数据以平均值表示 ± SEM(n = 5个独立实验,包括 ≥ 通过单向方差分析和Tukey的多重比较试验(**)确定每个细胞50个)和与溶媒对照组显著不同的值,P < 0.01; ***,P < 0.001; ****,P < 0.0001; ns,P > 0.05)

使用各种ER标记分析U-2 OS细胞的ER分布

为了验证我们的分析管道与其他ER标记物兼容,我们检测了几种过表达的荧光标记ER驻留蛋白,针对ER驻留蛋白的抗体,以及活细胞染色ER Tracker™(图)。6.)。我们选择了四种ER蛋白,每个蛋白质具有不同的功能,从先前在大规模亚细胞定位项目中表征的表达构建文库标记为不同的荧光蛋白(YFP)[50.,51.].据报道,在酵母中,保守的高尔基转运蛋白1B (GOLT1B)定位于ER出口位点(ERES)和顺式高尔基池[52.]并且在水稻胚乳细胞中两种细胞器之间介导的前进传输中的功能[53.].尽管尚未对人类直系同源物进行功能性描述,但也已证明GOLT1B-YFP融合蛋白定位于HeLa细胞中的内质网[51.]并且在U-2 OS细胞的实验中,Golt1B-YFP蛋白定位于管状结构,其与Ser小管和致密的Perinuclear ER具有高相似(图。6.A),表明它是一个善意ER标记。同样地,我们观察到的ER脂质筏相关蛋白的高信号(ERLIN2)54.],E3泛素 - 蛋白质连接酶Synoviolin(Syvn1)[55.和寡糖基转移酶复合物a (OST-A)镁转运体1 (MAGT1)的一个亚基[56.在U-2 OS细胞中的ER结构上的YFP标记蛋白质(图。6.一种)。我们改编了我们以前描述的管道为每个标记为每个标记设计的SEC61β-MEMERDD(附加文件2.:附录1,表2),并成功获得了ER多边形区域面积和密度百分比“RER”与单元面积成比例的指标(图。6.B, C)。

图6.
图6.

利用各种ER标记分析ER在U-2 OS细胞中的分布。A.显示U-2 OS细胞中SER多边形区域(第2列和第3列)和致密RER(第4列、第5列和第6列)序列分析的单个细胞图像,表达标记ER的各种结构(GOLT1B-YFP、ERIN2-YFP、SYVN1-YFP和MAGT1-YFP)(第1列)。BER多边形区域平均大小的量化。C在u-2 OS细胞中的细胞细胞质中的致密r%的定量表达每个ER定位蛋白的细胞细胞质。DU-2 OS细胞的代表性图像显示用抗Reep5抗体和内质网跟踪器标记的致密内质网(第2、3和4列)的序列分析™ (第1列)和细胞质中致密内质网百分比的定量(E)。Data are expressed as mean ± SEM (n = 3–4 independent experiments comprising ≥ 50 cells each). All scale bars = 20 μm

最后,我们希望评估我们的方法的适用性,超出使用过于表达的荧光标记的蛋白质。为此,我们首先使用免疫荧光方法,将我们的管道应用于免疫标签的ER居民蛋白质。我们测试的几种抗体仅产生了低信噪比。我们通过针对REEP5的抗体获得了最佳效果,尽管细胞周围染色弱并且没有显示连续小管(图。6.d)预定对多边形区域的分析。然而,我们能够使用抗REEP5抗体确定与细胞面积相关的密集'RER'的比例,因为它提供了细胞核区域中的强染色(图。6.同样,经常使用的ER Tracker染料不能强烈地标记SER小管,但可以使用我们的管道分析密集的“RER”结构(图。6.D、 E).总之,这些结果表明,我们的分析管道与一系列ER标记兼容,同时考虑到每个制造商的优势和局限性,他们也建议谨慎选择。

讨论

在该研究中,我们介绍了一种用于使用高含量荧光显微镜的ER的定量评估的自动图像分析管线。到目前为止,大多数关于ER形态学的研究已经定性;即将细胞器描述为“正常”或“异常”。定性研究仅限于视觉检测毛重变化,例如在高水平的压力或细胞毒性下可能发生,但通常不能检测更微妙,但生理上相关的变化。在进行定量分析时,它已手动应用[57.],一种方法,即劳动密集型,它妨碍了其在高通量筛查中的应用,因为识别可以修改疾病相关的ER改变的新型靶标。在这里,我们提出了两种新的定量特征,描述了细胞中的SER小管多边形区域和致密'RER'的比例。这些特征在一起使得Ser和RER的键结构能够在粘附的哺乳动物细胞系中可重复地量化。

我们的实验表明,稳定表达ER标记物Sec61β-Memerad的细胞系提供了最高的信噪比,这有助于我们的分析。我们还能够证明我们的分析管道也可以应用于其他细胞系(HeLa Kyoto),以及用不同类别的ER标记物染色的细胞。使用标记的ER驻留蛋白的过度表达来标记ER是一种广泛使用的策略,用于评估ER组织,但是改变的ER蛋白表达本身会破坏ER组织。例如,ER形成蛋白的过度表达会导致形成未分支的丝氨酸小管的缺失导致内质网扩张[40].与此一致的是,我们的方法检测到了er驻留蛋白GOLT1B过表达导致的SER和RER组织的变化[51.]和Erlin2 [54.].此外,我们的分析确定了E3泛素连接酶SYVN1的过表达导致U-2 OS细胞中的高性系多边形区域。这独立地支持最近的研究表明Syvn1过度表达通过泛素化介导的Atlastin-1抑制Servn 3来破坏Ser网络[55.]因此,我们的方法为筛选调节内质网形态和潜在内质网功能的蛋白质提供了机会。

这种自动化方法的主要优势在于,它能够快速筛选可以修改ER的遗传或化学制剂,因为这些制剂可能为病理条件(如以ER组织中断为特征的运动神经元疾病HSPs)提供新的治疗靶点。在这里,我们对几种与ER结构和功能相关的药物进行了初步研究,以验证该管道的使用,以检测ER组织的变化。Thapsigargin和tunicamycin是诱导内质网应激的有效途径。尽管许多研究表明内质网应激和内质网组织有关,但最近的证据表明,单独使用这两种药物中的任何一种都不足以破坏内质网的形态[58.,59.].同样地,我们在这里报道了用thapsigargin或tunicamycin处理U-2 OS细胞并不会显著改变管状SER多边形面积或致密RER的比例。脂质可得性与内质网形态有关[25.]确定并与饱和游离脂肪酸棕榈酸诱导ER膨胀和应力在几种细胞类型[治疗32.,60.,61.,62.,63.].在这里,我们表明,具有低浓度棕榈酸的处理增加了Ser多边形的面积。同样,肌动蛋白细丝在维护ER网络中具有保守的作用[35.,64.,65.[用肌动蛋白解聚药物细胞蛋白酶B治疗是否在显影卵母细胞中改变ER含量(导致卵母细胞激活期间皮质区域的ER积累)[37.,66.].与此一致的是,我们的管道能够检测到,短暂的细胞松弛素B处理诱导ER重组,SER多边形的面积显著增加。内质网的结构和功能是通过选择性自噬翻转(ER-phagy)来维持的,其损伤会导致内质网膜的异常扩张[67.].我们发现,自噬抑制剂Bafilomycin A1的处理显著减少了SER多边形的面积,增加了致密RER的比例。

结论

这些发现在一起,支持这种自动化管道的有效性,以分析ER功能。这种方法可以掺入大规模的基于图像的表型筛选中,其可用于鉴定在正常或疾病模型细胞中改变ER的遗传或化学试剂。

方法

细胞培养

稳定表达Sec61β-mEmerald的人骨肉瘤上皮细胞(U2-OS) [33.],慷慨地提供了克雷格百仕通(Blackstone)与1 g / L葡萄糖培养杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM) (Lonza lzbe12 - 707 f)含10%热灭活胎牛血清(Sigma-Aldrich F9665), 0.8%谷酰胺(热科学™25030024)和10μg / ml(或0.1%)g - 418 (Gibco 10131035),在37°C和5%湿润孵化器有限公司2..瞬时转染实验中使用的U-2 OS (ATCC®HTB-96™)和HeLa Kyoto (RRIC:CVCL_0042)细胞系在相同的条件下维持,但不使用抗生素。

药物治疗

U-2 OS细胞稳定表达Sec61β-mEmerald [33.]每孔接种4100个细胞(相当于1.3个细胞) × 104.每厘米的细胞2.)在CellCarrier Ultra96-孔光学透明板(PerkinElmer)。16小时治疗服装后24小时开始,而30分钟的治疗在播种后39小时开始。交错的处理允许同步固定和整个板的染色。将细胞用0.5%DMSO(Sigma-Aldrich D2650),250μm棕榈酸(Sigma-Aldrich P0500),50nM BafiLomycin A1(B1793 Sigma-Aldrich),100nm Thapsigargin(Sigma-Aldrich T9033),和500 nm unicamycin(Sigma-Aldrich T7765);并且30分钟,10μm细胞蛋白B(Sigma-Aldrich C6762)。

内质网定位蛋白的瞬时转染

未经转染的U-2 OS(RRID:CVCL_0042)和Hela Kyoto(RRID:CVCL_1922)细胞在每孔3500个细胞(相当于1.1×10时4.每厘米的细胞2.)在CellCarrier Ultra96-孔光学透明板(PerkinElmer)。播种后24小时,使用0.13μL的转介-X2(MiRus MiR6003)在20μLOptimem的最终反应体积中使用0.13μl的转络-X2(MiRus MiR6003),使用50ng的各种DNA构建体制备转染复合物。在室温下孵育20分钟后,将转染反应加入含有生长培养基的细胞中。用于转染U-2 OS细胞的YFP标记构建体是从先前描述的表达构建文库中获得的[50.,51.].对于不涉及瞬时转染的实验,U-2 OS细胞在培养结束时用ER-Tracker™(ThermoFisher E34251)染色或用抗reep5抗体(Proteintech 14643-1-AP)免疫标记。用Sec61β-mEmerald (Addgene plasmid #90992)转染HeLa Kyoto细胞[68.].所有病例的表达时间均为加入转染复合物后24 h。

成像的样品制备

在各种处理之后,用10μmHoechst33342(Thermo Scientific™62249)的预热溶液和1:1000稀释的Cellmask TM深红色质膜染色(Invitrogen™C10046),将细胞在37℃下孵育10分钟10分钟。在DMEM培养基中分别占据核和血浆膜。在ER跟踪器™染色细胞的情况下,使用1μM溶液(Thermofisher E34251)。接下来,用磷酸盐缓冲的盐水(PBS)缓冲液,pH7.4洗涤细胞,并在室温下用4%(w / v)多聚甲醛(PFA)固定15分钟。随后,用PBS溶液再次将细胞洗涤3次,并在该溶液中进行成像。在用抗REEP5抗体免疫染色的情况下,遵循额外的步骤,其在室温下在PBS中具有0.01%Triton-X(Alfa Aser A16046)的细胞膜渗透10分钟;30分钟封闭PBS中的0.5%FCS(Sigma-Aldrich F9665);1-H孵育抗REEP5抗体(Proteintech 14643-1-AP)在阻塞溶液中;然后用PBS洗涤3次;1小时孵育抗兔二次alexa 568抗体(Thermofer Simper A11036)在阻塞溶液中; and 3 final washes with PBS, after which cells were kept in this solution for imaging.

自动共组成像和分析

在使用63×/1.15A na水浸式目标的歌剧苯料高含量筛选系统(PerkinElmer)上,每次孔中获得跨越0.5μm的5个光学切片的两个光学切片的分组图像。XY分辨率为0.28μm。使用Harmony®V.4.8高内容分析软件(PerkinElmer)分析图像,用于管道查看附加文件2.:附录1.我们使用了一个由英特尔Xeon CPU的计算机,3.60 GHz包含80 GB RAM,并运行64位操作系统/ Windows 10 Pro。每台孔获取的每7×7个字段的近似计算时间为10分钟。一组样本图像(https://osf.io/nru7g/)已导出并用于在CellProfiler v.3.1.8上重新创建分析[2.],见附加文件2.:附录2用于管道。具体参数需要优化,如指示的附加文件2.:附录1和2,但一旦输入管道运行到提供的数据集完成。使用CellMask™通道实现细胞分割。在本文中,我们在细胞的群体中量化和分析了RER和SER形态,分析了每孔≥50个细胞。这确保了通过在复制实验之间分析的大量细胞核对培养细胞群体的固有变异性(比较图。5.b,c有附加文件1.:图S3)。原始数据文件包含每个对象和每个细胞的实验结果在本工作中描述的在线:https://osf.io/nru7g/

可用性数据和材料

该研究中分析的管道和样本原始图像,除了样本原始数据,还可以在OSF存储库中获得,https://osf.io/nru7g/. 本研究期间生成的其他示例图像数据可根据要求从相应作者处获得。

缩写

DMEM:

Dulbecco的改良Eagle的媒介

呃:

内质网

eres:

ER退出网站

ERLIN2:

ER脂质筏相关蛋白

GOLT1B:

高尔基体运输1 b

热休克蛋白:

遗传性痉挛性下肢瘫痪

MAGT1:

镁转运体1

氖:

核被膜

OST-A:

Oligosaccharyltransferase复杂

RER:

粗糙的呃

RFs:

复制的工厂

投资回报率:

感兴趣的区域

SER:

平滑呃

SYVN1:

Synoviolin

U2-OS:

人骨骨肉瘤上皮细胞

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下载参考

致谢

我们感谢Craig Blackstone提供的U-2 OS Sec61β-mEmerald稳定细胞系,以及JCS实验室成员在图像分析管道设计方面提供的建议。

资金

这项工作得到了SFI-HRB-Wellcome信托生物医学研究伙伴关系、爱尔兰研究理事会(IRC)和都柏林大学学院(UCD)的支持。NCO 'S获得了种子科学奖(授权号:202020/Z/16/Z)和UCD博士进步奖的支持。MEG-P项目由爱尔兰irc政府博士研究生资助(批准号:GOIPG/2018/3011)。JCS实验室的这项工作得到了爱尔兰科学基金会(SFI)的研究拨款的支持(拨款号16/RI/3745)。没有一个资助机构在研究的设计、收集、分析或解释数据或撰写手稿中发挥任何作用。

作者信息

从属关系

作者

贡献

MEG-P进行的一切实验和开发的自动化流水线。MEG-P,以及JCS NCO'S写和编辑了文本和制备的数字。所有的作者促成稿件修改,阅读并同意提交版本。

相应的作者

对应于Niamh C. O'Sullivan.

伦理宣言

道德认可和参与同意

不适用。

同意出版

不适用。

竞争利益

提交人声明他们没有竞争利益。

附加信息

出版商的注意事项

欧宝体育黑玩家Springer Nature在公布的地图和机构附属机构的管辖权主张方面保持中立。

补充信息

附加文件1:图S1。

ER分析细胞分析器中的管道。图S2。用于分析ER多边形区域和致密Perinuclear ER的管道应用于表达SEC61β-MENORALD的Hela kyoto(RRID:CVCL_1922)细胞。图S3。巴菲霉素诱导U-2 OS细胞内质网重组。

附加文件2:附录1。

用Harmony进行ER分析的分析顺序:和谐中的连续构建块。表2。管道设置调整不同的实验。附录2。图S1中使用CellProfiler进行ER分析的分析顺序。

权利和权限

开放访问本文是基于知识共享署名4.0国际许可,允许使用、共享、适应、分布和繁殖在任何媒介或格式,只要你给予适当的信贷原始作者(年代)和来源,提供一个链接到创作共用许可证,并指出如果变化。本文中的图像或其他第三方材料都包含在本文的知识共享许可中,除非在该材料的信用额度中另有说明。如果资料不包括在文章的知识共享许可协议中,并且你的预期用途没有被法律规定允许或超过允许用途,你将需要直接从版权所有者获得许可。如欲查阅本许可证副本,请浏览http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.Creative Commons公共领域奉献豁免(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)适用于本文提供的数据,除非在数据的信贷额度中另有说明。

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Garcia-Pardo,M.E.,Simpson,J.C.&O'Sullivan,N.C。一种新型自动化图像分析管线,用于量化培养的人细胞内质子网的形态学变化。欧宝娱乐合法吗22,427(2021)。https://doi.org/10.1186/s12859-021-04334-x

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关键词

  • 内质网格形态
  • ER函数
  • 高含量的成像
  • 自动图像分析